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(無題) 削除/引用 No.452-7 - 2011/05/28 (土) 16:20:22 - 310 T様ありがとうございます。 ＞4ml のゲルがあれば 400ul ずつ 10 回に分けて載せればいいだけですよ。 これは知りませんでした。RNAやDNAのカラムで入れすぎた時のように詰まったり吸着が低下するのかと思い。先ほど結合と溶出を２サイクルしました。途中でQGの洗いを忘れて、再度カラム吸着と洗浄をした事もあり、回収率は50％くらいでしたが、必要な量はとれましたので、ひとまず安心しました。 泳動できるDNA量ですが、コーム幅6mmで700ngのDNA(150bp)が十分分離していましたので、多分1ugくらいまでは大丈夫な気がします。ただT様の方法で行えば、ゲル量が増えてもさほど問題にならなそうなので、当面は現状と同じ程度の泳動量にしようと思っております。

(無題) 削除/引用 No.452-6 - 2011/05/28 (土) 13:14:21 - Ｔ 400mg というのは単に物理的な容積の問題なので、例えば 4ml のゲルがあれば 400ul ずつ 10 回に分けて載せればいいだけですよ。溶出まで行く必要はなく、ゲル溶液を載せて遠心し、濾液を除いてまた新たにゲル溶液を載せる、を繰り返せばいいのです。最後にまとめて溶出です。 さすがに10回はやった事ないですけど、回収効率を上げるために濾液をもう一度カラムに載せるなどは普通にやっています。 もちろんカラムの DNA 結合容量（5ug ですか？）はありますが、トータルしても DNA 量はその遥か下ですよね。

(無題) 削除/引用 No.452-5 - 2011/05/28 (土) 04:13:47 - 310 おお様ありがとうございます。 700-800ngを6mmウエルで流すことにします。150bpの短いDNAなので4v/cm（120V) で多分大丈夫だと思います。中央に超過変領域をはさんでいるので、非変性条件下では、ヘテロ2本差が形成されて、ぼわっとした感じのバンドになります。普通のシングルバンドより薄く見えますが、これが収拾つかなくなるほどブロードになると、染まりが弱くてちょっと厄介だったので、泳動できる量の上限を聞いた次第です。ありがとうございました。 以下、DEAEの余談になります。 最初にいたラボでは、5kb以上はDEAE吸着で、それ以下はグラスミルクで取ってました。長いDNA断片だと5-10ugのDNAを5cmまたは10cmのでっかいコームで1-2V/cmで泳動して、吸着時には倍くらいに電圧を上げて泳動していました。いかにきれいに切れ目が入れられるかが腕の見せ所という、当時不器用な私が結構苦労した実験でもあります。 最近よそのラボでTaKaRa RECOCHIPを使わせていただきました。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?catcd=B1000736&subcatcd=B1000743&unitid=U100003794 これもDEAEと同じ要領なのですが、泳動中にチップをさしこみちょっと泳動したら、エッペンに入れ遠心後直ちにクローニングに使えたので、これは楽だと感動しました。 うちのラボには特売の時にまとめ買いしたQiagenの試薬がたくさんあるので、当分は買えませんが、お勧めです。

(無題) 削除/引用 No.452-4 - 2011/05/28 (土) 03:24:45 - おお どの程度しっかりした分離を考えているのかにもよりますけど、サザンで10マイクログラムていど、それ以上多いとよくない(もちろんゲルのおおきさとかにもより多く載せるためにでっかいゲル、とウェルをつかってゆっくり流すひともいます)といわれています。 ただし10マイクログラムが一つのバンドとして同じ位置にくるとちょっと厳しいだろうというきもします。2ー3マイクログラムまでかなぁと勝手な想像をしています(はば3mmなら確かにそれでもちょっとおおいかもしれません)。エチブロを使わないのである程度量が必要とも思いますし、エチブロで汚いなあというバンドでも感度をおとした染色ほうではきれいに見えたりしますので、そういう意味では若干多くのせてもまだ許容範囲かもしれません(逆もしんなりですけど)。 こういう場合は電気へエイどう後DEAEフィルターのほうがやりやすいかもと思ったりしますが、やったことがないのでどうもはっきりしたことがいえません。染色でバッファーが置換されると問題があると思いますが。 DEAEのカラムなど使うとキャパに合わせてカラムを使うこともできますが、どうなんでしょうか。 すべて感覚からの想像です。

(無題) 削除/引用 No.452-3 - 2011/05/28 (土) 01:53:35 - 310 とおり係様 貴重な情報ありがとうございます。400mgのゲル上限は、溶出段階まで進むと解消されると言う事だと了解しました。特に一本のバンドではなく一定の分子量の範囲を切り取るときは、ゲル量が思いのほか増えるので、教えていただいた方法を使わせていただきます。 アガロースゲルで、1ウエルあたり、どのくらいの量のDNAを泳動できるか、Takaraに聞いたところ、”ウエル幅3mmで100ng、6mmで300ngまで大丈夫かな？ゲルの厚さを増やしても泳動できる量は変わらないよ。でも試してみないと分からないね。”との返答でした。ただこれまでのDNAマーカーの泳動結果を見ると、この倍はいけそうと思っていますので、自己責任でやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.452-2 - 2011/05/27 (金) 19:04:23 - とおり係 分離する相手にもよるかと思いますので、直接の回答は持っていませんが、Minelute Gel extraction kit、ゲルが多いときにカラムを使いまわし（溶出後、またゲル溶解液を同じカラムに加える）していましたが、4回は余裕で使えました。 マニュアルには5ugまでのDNAと書いてあるので、チャンピョンデータでそのあたりなのでは。

アガロースで分離できるDNAの最大量 削除/引用 No.452-1 - 2011/05/27 (金) 13:38:28 - 310 アガロースで分離できるDNAの最大量はどのくらいでしょうか？ 条件は Gel: Seakem LE 2% with 0.5xTBE Buffer: 0.5ｘTBE コーム幅　3mm DNAサイズ　150bp PCR product 電圧　4V/cm (120V/30cm) ゲルの厚さ 8mm 泳動後にMupid Blueで染色しQiagenのMinelute Gel extraction kitで抽出する予定です。1カラムあたりのゲル処理量が400mgまでなので、できるだけ多くの量を1レーンに泳動したく思っております。 初歩的な質問で申し訳ありませんが、ご教示のほどよろしくお願いいたします。

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