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免疫染色時の透膜処理 トピック削除
No.466-TOPIC - 2011/05/31 (火) 11:51:44 - 素人
免疫染色時の透膜処理は、一次抗体を処理する前だけで充分ですか？或は、一次抗体希釈液、二次抗体希釈液やwash bufferにもTriton（など）を入れた方がいいですか？
宜しくお願いいたします。
　
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No.466-8 - 2011/06/07 (火) 17:28:58 - 組織
透過処理で抗原が流出したり，局在が変わる可能性は無視できませんが，実用上，透過処理によってバックグラウンド染色が抑えられ，シグナルが見やすくなることはあります．透過処理あり/なしで比較すれば，その辺りも検討できるのではないでしょうか．

私は一次抗体前だけ処理してます．

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No.466-7 - 2011/06/07 (火) 16:47:16 - 素人
waonさん、taniさん、ABZOさん：

コメントどうもありがとうございます。

言い忘れましたが、マウス骨髄の脱灰後のOCT包埋の凍結切片を使用しています。確かにパラフィン切片（いつも6umで切っています）の場合は透膜処理をしていません。凍結切片の染色時も、抗原によって表面活性剤を使っちゃいけない場合があること、勉強になりました。どうもありがとうございます。

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No.466-6 - 2011/06/04 (土) 18:34:59 - ABZO
特別な理由がないならば、一般的には組織切片では透過処理は必要ないと思う。細胞は薄切時に切れて断面が露出しているとおもうし、それにパラフィンなら包埋過程、凍結でも固定時などに有機溶媒に晒せば膜関係はすかすかになってると思うので。12μmということは凍結切片かな。固定方法とかにもよるけど、抗原によっては界面活性剤で処理すると流失してしまう可能性もあり得るのでその方がむしろ気になる。

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No.466-5 - 2011/05/31 (火) 19:15:40 - tani
切片はパラフイン？　凍結切片だと思っていました・・・が

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No.466-4 - 2011/05/31 (火) 15:06:49 - waon
切片が厚すぎますね。
骨髄細胞内をみたいのであれば、パラフィン切片なら２〜４μｍぐらいがよいかと思います。

薄ければ、特別に透過処理は必要なくなるかもしれませんね。

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No.466-3 - 2011/05/31 (火) 13:41:50 - 素人
taniさん：

お返事ありがとうございます。

確かに一段階一段階自分で細かく確認するしかないですね。条件をもう少し詳しく説明させていただくと、以下のとおりになります。また、何かコメントがありましたらどうぞ宜しくお願いいたします。

マウス骨髄の切片で、12umの厚さです。今回は、細胞内に発現している分子をみたい時にかぎって質問させていただきました。透膜処理として、0.1% TritonX 100を使用する予定です。

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No.466-2 - 2011/05/31 (火) 12:57:07 - tani
組織の海面活性剤処理はしなくて済むならしない方がいいです。
膜や組織をどんどん壊しますから形態も壊れます。そのリスクを負ってでもシグナルを検出しなければならないならしなければいけません。が、どの段階で使用するかは抗体の性質や組織の厚さ、蛋白の受容体などによってさまざまですからそれは素人さんが、一次抗体に入れたとき、入れない時。PBS に入れた時、入れない時、染色の全ステップで同じことを細かくやってみて自分でデーターを取るしかありません。使用は必要最小限にとどめる、と考えたほうがいいでしょう。

免疫染色時の透膜処理 削除/引用
No.466-1 - 2011/05/31 (火) 11:51:44 - 素人
免疫染色時の透膜処理は、一次抗体を処理する前だけで充分ですか？或は、一次抗体希釈液、二次抗体希釈液やwash bufferにもTriton（など）を入れた方がいいですか？
宜しくお願いいたします。
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