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(無題) 削除/引用 No.478-7 - 2011/06/08 (水) 00:55:18 - うえお テンプレートの確認をまずするほうがよいと。 プラスミドからとってきたもので、増幅後変異がはいっていれば、 私ならば、pcrを疑います。high fidelityでもまれに変異ははいります。 増幅領域はどれくらいの大きさなのでしょうか。 テンプレートが組織ゲノムならばsnpもうたがわなければなりません。 さらに、変異としているということはなにかの配列を 参照しているわけですが、その元配列に疑う余地はありませんか？ わたしは、ラットの遺伝子をクローニングしていたとき、 別チームからのむかーしの配列とあわなかったとこがあります。 いろいろみてみたら、たぶん昔の配列はアーティファクトのようでした。

(無題) 削除/引用 No.478-6 - 2011/06/06 (月) 23:07:51 - AP 自分のPCR産物の配列とレファレンスの配列が食い違っていて、それが単なる多型であってどちらも材料生物由来の正しい配列なのか、それともPCRのエラーによるアーチファクトなのかということが問題になる場合、 まずPCR産物をダイレクトシークエンスする、というのは結構一般的な戦術だと思います。散発的に生じる塩基置換は、PCR産物全体から見ると少数派なので、ダイレクトシークエンスでは本来の配列が読めてきます。

(無題) 削除/引用 No.478-5 - 2011/06/06 (月) 22:12:50 - ops フィディリティの高いＰＣＲ酵素でクローニングし、 シークエンスを確認して、データベースと異なる塩基があった場合ですが、 私は、 シークエンスの波形データを見て再確認 ＳＮＰかどうかをデータベースで確認 アミノ酸に翻訳された場合、アミノ酸が変わるかどうかの確認 レアコドンになっていないことの確認 して、多くはＳＮＰであろうと考察をし、 タンパクの発現も問題無いだろうと解釈して そのまま使っています。 まあごくまれに、ＰＣＲによる変異もありますが・・・。 （その場合、複数クローン読めば、分かります。）

(無題) 削除/引用 No.478-4 - 2011/06/06 (月) 21:24:53 - Actias 複数クローンを調べて、その場所にエラーが有ったり無かったり、ということですよね？ たった1例の観察で、一般化するのは、間違いのもと。 再現性があるかないかが大事です。 再現良く、同じ箇所に同じ置換があるなら、参考にしたデータと入手したモノの配列の間で違いがあった、と考えてよろしいかと。

(無題) 削除/引用 No.478-3 - 2011/06/06 (月) 18:14:58 - AP 精製された一種類（あるいはニ種類程度のカクテル）の酵素で合成反応を行うのと違って、生体内では、DNAポリメラーゼにも異なるキャラのものが複数あり（たとえば校正活性のあるもの、ないものが場面別に使い分けられている）、また、いろいろなDNA修復系とそれにかかわる多種類のタンパク質が存在しているので、DNA複製で起こるエラーが非常に起こりにくいようになっています（そうじゃなきゃ、生物種として生きながらえないでしょうから当たり前ですが）。 細胞内でのDNA複製のエラー率を（大腸菌からの数字を元にしていると思いますが）教科書から引くと、 DNAポリメラーゼが間違った塩基を取り込む頻度　10^-5のオーダー（校正活性のないTaqなどのエラー率もそんなもんだと思います）。 そのうち、そのDNAポリメラーゼの校正活性で、すぐさま99%は訂正されるので、残されるエラーの頻度は、10^-7のオーダー。 残ったエラーの99.9%は、DNA複製後にミスマッチ修復系で修復されるので、 結局、生体内のDNA複製で、間違った塩基が入る頻度は10^-10(10 Gbに1〜数塩基程度）。

(無題) 削除/引用 No.478-2 - 2011/06/03 (金) 00:57:17 - おお http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/repair.htm http://kusuri-jouhou.com/creature2/heni.html I think propagation of plasmids in E coli is way too accurate compared with PCR enzymes like Pfu.

プラスミドベクター構築での疑問 削除/引用 No.478-1 - 2011/06/03 (金) 00:29:27 - pon 現在初めて安定発現株の取得を目的として、プラスミドベクターの構築に取り組んでいます。 目的タンパク質の塩基配列をPCRで増幅し、その塩基配列を導入したプラスミドベクターを大腸菌へ形質転換、クローンを取得後に、シークエンス解析で塩基配列のチェックを行ったのですが、目的塩基配列中に塩基が異なる増幅エラーが何ヵ所か見つかりました。 正確性が高いポリメラーゼを使用してしますが、エラーが完全に無いわけではないということで、このエラーはPCRで塩基配列を増幅した際に起こったものと考えておりす。しかし、大腸菌の増幅の際にエラーは起こりうるものなのかということが疑問として湧いてまいりました。 エラーが起こるならば、どのような機構で起こるのか教えていただけますと幸いです。 ご存知の方がいらっしゃいましたら、何卒よろしくお願いいたします。

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