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(無題) 削除/引用 No.486-4 - 2011/06/05 (日) 20:05:29 - コンタミ >>q様 レス感謝します。 BsrG1部分について検討を行ってみます。 >>おお様 レス感謝します。 大変参考になりました。とりあえず設計してPCRしてみます。

(無題) 削除/引用 No.486-3 - 2011/06/05 (日) 13:56:36 - おお プライマーのTmは単なる目安で厳密にそれからPCRの温度を設定する必要はありません。プラスミドなど比較的テンプレートの複雑度が低い時はとくに不特異の増幅も少なくなる傾向にあると思います。まあPCRかけてみればいいかと思います。タッチダウンを使うと気分的には解決しやすいと思います。アニーリング温度を高い方から、サイクル数に伴い徐々に下げていく方法です。 どうしてもという場合はネストで2段階で伸ばしていくという方法も取れますし、HISTAAの部分をオリゴで二本鎖をつくって3ピースでPCR産物とともに挿入するか、段階的に挿入してもいいかもしれません。 ストップの前に使える制限酵素があるかもという指摘ですのでそれだとPCRすら必要ないですね。

(無題) 削除/引用 No.486-2 - 2011/06/05 (日) 09:20:00 - qq EGFPの終止コドン直前のBsrG1部位（使った亊ないですがNEBにあるそうです）で開いて、His6のDNAで埋める。 クローニング後、タンデムに複数入っているものを除去する必要があるかもしれません。 PCRに関しては、ノンスペがやや増える可能性もありますが、低いTmのプライマーの方に合わせてPCRをかけるだけで良いように思えます。

pcdna3からのEGFPクローニング 削除/引用 No.486-1 - 2011/06/05 (日) 05:57:29 - コンタミ こんにちは。 研究で、ベクターの設計を行っています。EGFPをpcdna3-EGFPよりクローニング する予定なのですが、下のようにHISタグを付加したいため、EGFPの終止コドン を削りたいのですが、実質的なEGFPの効果部位が分からず困っています。 addgeneではegfp用のプライマーを記載していましたが、tm値を計算した所非常 に高い値となりました。(primer3使用)このような場合、どういった解決方法が あるでしょうか？宜しくお願い致します。 Foward :Kpn1-EGFP(5' - 3') Reverse:EGFP-HIS-TAA-Hind�V(3' - 5')

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