Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

DNAヘテロ２本鎖からホモ２本鎖 トピック削除
No.487-TOPIC - 2011/06/05 (日) 12:31:48 - 310
いつもお世話になっております。

中央に超可変領域を含むRNAのRT-PCRを行い、制限酵素処理で超可変領域の配列のみを持つDNAを抽出しようと思っています。抽出するDNAは50-60bp程度で0.5ugを下限目標として実験を行っています。しかし、PCR産物が一定量を超えてしまうほどのPCRサイクルですと、非変性のアガロースまたはアクリルアミド泳動で目的サイズから分子量が高い方向にスメアが高い頻度で出てしまいます。しかし蛍光プライマーとGENESCANを使い、一本鎖に変性させると、スメアと本来の位置で見えるバンドは同じサイズでした。

また制限酵素で切り出した可変領域外のバント(35bp)は非変性20%アクリルアミド上で、きれいな１本のバンドで見えるのに対し、50-60bpの超可変領域を含む配列は、ぼやけたバンドと200bp位までのスメアで構成されています。

サイクル数の調整やnestedPCRで何とかできないかと、最適化を行いましたが、ヘテロ２量体が出来ない程度にサイクル数を抑えると、産物量も薄くなりすぎてしまうし、サンプルRNAが非常に少なく、発現レベルが分からない状態でPCRしなければならないため、ヘテロ２本鎖の形成を抑えるのは難しそうです。

制限酵素消化の確認やゲル抽出の都合上、出来ればきれいなバンドになってもらいたいと思っています。

今考えているのは、プライマーの片側をリン酸化しておきλエキソヌクレアーゼで分解した後、新しくリン酸化していないプライマーを加え、２本鎖の合成を行う方法です。１本鎖にするまではDNAシークエンスに使うテクニックなので、良いキット、参考文献やマニュアルをお教え頂ければ幸いに存じます。

これがダメな場合、PCR産物を大幅に希釈した後、１サイクルだけのPCRをしてカラム又はエタ沈で濃縮しようと考えています。プライマー過剰の条件ではPCR産物同士のアニーリングは抑えられるはずと思っているからです。

これ以外でDNAのヘテロ２本鎖をホモ２本鎖にする方法をご存知な方、ご教示をよろしくお願いいたします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

uFItCGRlLfXGW 削除/引用
No.487-9 - 2012/03/02 (金) 03:44:22 - rhanuz
qLXNXb <a href="http://jwuojvyukoxm.com/">jwuojvyukoxm</a>

HdYnWoGCDKkUpvVSUCc 削除/引用
No.487-8 - 2012/02/28 (火) 18:01:49 - aglqlh
CheIyb <a href="http://kydzaijyyttj.com/">kydzaijyyttj</a>

IJaMIISqZklFaZKyr 削除/引用
No.487-7 - 2012/02/28 (火) 15:03:31 - Judia
To think, I was cnosfeud a minute ago.

(無題) 削除/引用
No.487-6 - 2011/06/07 (火) 05:16:06 - 310
馬鹿なことをしていました。

計算してみたところ、ターゲット110bpあたりの最終産物10-100ng/ulのPCR producは0.138-1.38uM。一方プライマーは0.25uM。しかも、プライマーは後の実験でつかう5'付加配列のせいで30mer程度になって、アニーリング速度が落ちています。

これでは、ヘテロ２本鎖を作るために実験をしている様なものでした。

またこれまでの最終産物10-100ng/ulのPCRの結果から、おそらく1ng/ulまでPCR産物を希釈すれば、ヘテロ２本鎖が目立つほど増加することは無さそうなので、この条件でヘテロ２本鎖の解消を試してみます。

(無題) 削除/引用
No.487-5 - 2011/06/07 (火) 04:43:32 - 310
おお様、ご助言ありがとうございます。

>やはりスケールを大きくした方がいいのかと思えます。
抽出できるRNA量によりますが、コントロールではRT反応液を10倍以上希釈してPCRを36サイクル反応させますと、バンドが薄いので分かりにくいですが、目的産物のバンドだけアガロースで見えます。

しかし抽出できるRNA量が不明（今まで行った一連の実験の中で最小量で定量不可能かもしれない）で、目的クローンの発現量がわからず、失敗が許されない1回勝負ため、ヘテロ結合体が形成されても増やしておいて、おお様の言うとおり、

>最終的には1本のチューブが96ウェルという感じ。

くらいのスケールで、1回PCRサイクルを回そうと思います。極論を言えば、１ウエル１コピーまで希釈すれば、ヘテロ２重鎖は全く出なくなりますが、そこまでは出来なさそうですので、ご指摘くらいのスケールでやろうと思います。ありがとうございました。

AP様、ご教示ありがとうございます。

>分子量が1/10から1/100程度である50-60 bpなら、重量収量は、100 ng以下が>相当ではないでしょうか。

おっしゃるとおりです。しかし初めての実験なので、できるだけマニュアルのとおりやろうと思っていました。現時点では39サイクルのPCRで増幅し、ゲル切り出しー制限酵素処理ーゲル切り出しをやると100ngにも届かず、2段階PCRで増やして鋳型量を増やそうとすると、ヘテロ複合体が多量に出るので、ご相談した次第です。

実はヘテロ２本鎖の形成は過去にHigh Resolution Melting Tempertureを行った際に形成が確認されていました。制限酵素認識/切断部位ではないことと、AP様がご指摘された
＞大きく上にスメアしているのはヘテロ二重鎖といっても、ある鎖のある部分＞が別の鎖のカウンターパートではない不正な位置にアニールしているんじゃ＞ないかと思います。
と言う概念が欠けていたため、甘く見ておりました。アニールのされ方で4量体形成もありそうで、これらの分子ではAP様のおっしゃったとおり

＞正しい位置で二重鎖になっていなければ、制限酵素は効きません

となるため、制限酵素切断前にスケールアップしたPCR反応でできるだけヘテロ接合体を排除するつもりです。

プライマーリン酸化ーラムダエクソヌクレアーゼ消化によるPCR産物1本鎖は、ダイレクトシーケンスの前処理として期待していた時もあり、この機会に情報が入ればと思ったのですが、思いのほか、行っている方は少なそうですね。

(無題) 削除/引用
No.487-4 - 2011/06/07 (火) 00:36:22 - おお
PCRについてはいろいろ検討したということで書かなかったのですが、思いつく点をあえて書きます。

やはりスケールを大きくした方がいいのかと思えます。10サイクル回し反応溶液を10倍にしてまた10サイクル、さらに10倍して10サイクルとか。。。最終的には1本のチューブが96ウェルという感じ。

プライマーの量を可也多めにいれる(ただしノンスペは怖いですね。そうなるとネストで2段階目は大量のプライマーを入れることになるかもしれませんね)。

変性の時間、身長の時間を十分に取る非常に短いフラグメントなのでそんなに長く必要ないはずですがあえて1分とか伸長時間を取ってみるなどでしょうか。

特に後の2つはどの程度解決するか分かりませんけど。。。

(無題) 削除/引用
No.487-3 - 2011/06/06 (月) 22:59:31 - AP
>50-60bp程度で0.5ugを下限目標として実験を行っています。

ダウンストリームの実験がどのようなものなのかはわかりませんが、そんなに大量に必要なのでしょうか。収量を重量でみると少ないように思えても、分子数としては十分ということはないですか。

よくある数百から数千塩基対のPCRでは、とてもうまく増幅がかかっても収量の限度は1 ug以下じゃないですか。PCR産物の長さにかかわらず、一反応のPCRで得られるDNA断片の分子数（モル数）は同程度になるとすると、分子量が1/10から1/100程度である50-60 bpなら、重量収量は、100 ng以下が相当ではないでしょうか。無理にそれ以上増やそうとしたら、鋳型DNAが過剰（鋳型のモル濃度が過剰）やサイクル数過剰の場合によくあるように、鋳型同士のヘテロ二重鎖の形成や重合が起こって、まさに今、問題になっているような結果が生じても不思議はないと思います。

本当に重量で0.5 ug分必要なら、スケールアップするとか、同じPCR反応を10本くらいやって、産物をプールするしかないと思います。


>また制限酵素で切り出した可変領域外のバント(35bp)は非変性20%アクリルアミド上で、きれいな１本のバンドで見えるのに対し、50-60bpの超可変領域を含む配列は、ぼやけたバンドと200bp位までのスメアで構成されています。

大きく上にスメアしているのはヘテロ二重鎖といっても、ある鎖のある部分が別の鎖のカウンターパートではない不正な位置にアニールしているんじゃないかと思います。正しい位置で二重鎖になっていなければ、制限酵素は効きませんので、そういうやつらはスメアのままでしょう。正しい位置で二重鎖になった物だけが制限酵素で切れて、きれなアームのバンドを生じているのでしょう。

(無題) 削除/引用
No.487-2 - 2011/06/05 (日) 13:44:46 - おお
思いつきだけで書かせてもらいますので現実味があるかどうかなんともわかりませんけど、アイデアとして何かのたしになればと思います。

一方のプライマーだけビオチンとかFITCとかをつけてタグをしておいてPCRで得られた産物を一本鎖に変性ご、タグたついている鎖だけを回収し、反対側のプライマーでクレノーなどで二本鎖にしあげてはと思いました。もちろんPCRようの酵素でも大丈夫だと思いました。プライマーのFとRに違うタグを入れておけばえられたPCRフラグメントから理論上2倍回収できますね。
制限酵素でタグの部分を切り離せるなら、完全に2本鎖が完成したDNAをレジンから遊離させることができるかもしれません。

すべて空想での構想ですが。。。

DNAヘテロ２本鎖からホモ２本鎖 削除/引用
No.487-1 - 2011/06/05 (日) 12:31:48 - 310
いつもお世話になっております。

中央に超可変領域を含むRNAのRT-PCRを行い、制限酵素処理で超可変領域の配列のみを持つDNAを抽出しようと思っています。抽出するDNAは50-60bp程度で0.5ugを下限目標として実験を行っています。しかし、PCR産物が一定量を超えてしまうほどのPCRサイクルですと、非変性のアガロースまたはアクリルアミド泳動で目的サイズから分子量が高い方向にスメアが高い頻度で出てしまいます。しかし蛍光プライマーとGENESCANを使い、一本鎖に変性させると、スメアと本来の位置で見えるバンドは同じサイズでした。

また制限酵素で切り出した可変領域外のバント(35bp)は非変性20%アクリルアミド上で、きれいな１本のバンドで見えるのに対し、50-60bpの超可変領域を含む配列は、ぼやけたバンドと200bp位までのスメアで構成されています。

サイクル数の調整やnestedPCRで何とかできないかと、最適化を行いましたが、ヘテロ２量体が出来ない程度にサイクル数を抑えると、産物量も薄くなりすぎてしまうし、サンプルRNAが非常に少なく、発現レベルが分からない状態でPCRしなければならないため、ヘテロ２本鎖の形成を抑えるのは難しそうです。

制限酵素消化の確認やゲル抽出の都合上、出来ればきれいなバンドになってもらいたいと思っています。

今考えているのは、プライマーの片側をリン酸化しておきλエキソヌクレアーゼで分解した後、新しくリン酸化していないプライマーを加え、２本鎖の合成を行う方法です。１本鎖にするまではDNAシークエンスに使うテクニックなので、良いキット、参考文献やマニュアルをお教え頂ければ幸いに存じます。

これがダメな場合、PCR産物を大幅に希釈した後、１サイクルだけのPCRをしてカラム又はエタ沈で濃縮しようと考えています。プライマー過剰の条件ではPCR産物同士のアニーリングは抑えられるはずと思っているからです。

これ以外でDNAのヘテロ２本鎖をホモ２本鎖にする方法をご存知な方、ご教示をよろしくお願いいたします。
全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。