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(無題) 削除/引用 No.59-11 - 2012/04/03 (火) 06:23:38 - TARO LacZ染色と免疫染色は両立が難しいです。その理由はLacZ染色で得られる青色の染色物質が蛍光波長を吸収するからです。対策としてはLacZ染色を調節して発色を抑える、か、DAB染色で解決している既報告もみられます。

(無題) 削除/引用 No.59-10 - 2011/02/24 (木) 00:12:02 - チャウチャウ X-GALの活性染色をするときはglutarが使われることが多いですが、普通に4％formamideでする場合もあります。 基本、免疫染色で動いている固定法でやってみてはいかがでしょうか。 免疫染色にとっては固定過剰になっているのではないかと想像します。

(無題) 削除/引用 No.59-9 - 2011/02/23 (水) 23:37:38 - ぼんすけ Boston-Pullmanさん 有難うございます。論文を検索してみます。 また、参考になるご意見がありましたらよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.59-8 - 2011/02/23 (水) 19:07:11 - Boston-Pullman spermatogonoal stem cell の研究では、移植実験で好んでlacZ染色が行われています。 その辺りの論文を検索すれば、メソッドが見つかるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.59-7 - 2011/02/23 (水) 12:57:31 - ぼんすけ APさん その免疫染色についての抗体は、先にも申しました通り、ある分化マーカーの抗体なのですが、割と良く染まります。パラフィン切片の場合、抗原賦活化をしてからのDABで染めた場合、賦活化なしで蛍光で染めた場合とも染まります。

(無題) 削除/引用 No.59-6 - 2011/02/23 (水) 12:46:39 - ぼんすけ AAさん。ご返事ありがとうございます。 Xgal染色後の免疫染色に使う抗体はある分化した細胞に特異的に発現するタンパクに対する抗体なのですが、通常の（Xgalを併用しない）場合の染色については4% PFAのO/Nしか試しておりませんでした。 一度、固定条件を振ってみようと思いますが、この場合Xgalで染めた後の固定を強めたらよいのでしょうか？4℃、O/Nで12時間程度やっておりますが、もうちょっと長くですかね？？　それとも前固定でGAを使わずに、4%PFAで少し長めにしたりするのもありですか？

(無題) 削除/引用 No.59-5 - 2011/02/23 (水) 12:37:44 - AP ところで、その免疫染色というのは、X-GAL染色なしのパラフィン切片では、うまく動いているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.59-4 - 2011/02/23 (水) 11:54:39 - AA X-gal染色は条件として固定が弱い方がよく染まりますが、免疫染色は抗体によって固定が弱いと染まりません。 私が使っているanti-beta-gal抗体(ケミコン、プロメガ等)がまさにそうです。 もしX-gal染色の固定条件で免染を試されたのでしたら、一度固定を強くして試してみることをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.59-3 - 2011/02/23 (水) 00:43:13 - ぼんすけ APさん、ご返答有難うございます。 LacZを抗体で染めるのは考えましたが、non-speが多くなるのと、LacZ陽性部分がすごく少ないので、可能ならば青くなっているところを確認して、青い所に絞って染色を加えられたらと考えておりました。良い案がありましたらお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.59-2 - 2011/02/22 (火) 23:32:10 - AP まず免疫染色ができるを条件に従い、anti-beta-Gal抗体を使って、二重免疫染色をする。

Xgal染色後の免染 削除/引用 No.59-1 - 2011/02/22 (火) 23:14:35 - ぼんすけ まだまだ駆け出し研究員のぼんすけです。 いつも勉強させてもらっております。 腸管でwholeのXgal染色をした後、分化マーカー等での免疫染色を行おうと思っておりますが、なかなか免疫染色のほうがうまくいかず困っております。抗原賦活化も行っておりますが、全く染まってくれません。 どなたか良い方法をご教授いただければ幸いです。 Xgal染色のプロトコールは �@小腸を摘出し、PBSで腸管を洗浄。 �A前固定液(1% folmaldehyde, 0.2% Glutaraldehyde, 0.02% NP-40 in PBS)で4℃、1時間固定。 �B前固定液を捨てて、PBSで20分ずつ2回洗う。 �C発色液(5mM K3Fe(CN)6, 5mM K4Fe(CN6, 1mM MgCl2, 0.02% NP40, 0.01% Deoxycholate Na, 1mg/ml Xgal)を注いで遮光、O/Nでincubate (室温) �D発色液を捨ててPBSで20分ずつ2回洗う。 �E4% PFAでO/Nで後固定 �F後固定液を捨てて、PBSで20分ずつ2回洗う。 �Gエタノールで脱水後、パラフィンブロックへ。 免疫染色は通常通りと思います。 抗原賦活化はpH6.0のクエン酸バッファーで97℃以上、15分です。 前固定でGAを入れているのが免染で染まりにくい原因かもしれませんが、Xgalの発色を得るためには入れたほうがいいと聞きます。PFAだけでもできるかもしれませんが。。。 よろしくご教授のほどお願い申し上げます。

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