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(無題) 削除/引用 No.617-15 - 2011/10/25 (火) 22:49:18 - A mRNAスプライシングの研究をしているとよく遭遇します。PCRのサイクル数が多すぎてプライマーが足りないときに。 ヘテロduplexの含まれたPCR産物を希釈して鋳型にして、プライマー多めで再度PCRをすると消えるのですぐわかります。

(無題) 削除/引用 No.617-11 - 2011/07/19 (火) 08:44:29 - 310 質問の答えとして的確では無いかもしれませんが、私もヘテロ鎖の形成に困っていました。ただ、私の場合ヘテロ2量体はそれぞれのホモに比べ高い分子量を示しました。ヘテロの部分の構造がどの程度アガロースに引っかかって泳動が遅くなるのかは、サンプルによって異なると思いますので、違っても不思議はないでしょう。 私の場合、鋳型量が増えすぎ、プライマーのアニーリングとエクステンションによる確実なホモ2量体形成が鈍ったためと判断し、精製、定量、希釈してプラトーにならない程度のPCRを再度行ったのち濃縮する事で、ヘテロなバンドを消すことに成功しました。 この方法はルーチンの操作としては煩雑なので、GENESCANを含む変性ゲルでの一本鎖の解析が泳動へのヘテロの影響回避に役立つと思います。前述の私のヘテロ2量体もGENESCANをかけたら、消滅しました。

(無題) 削除/引用 No.617-10 - 2011/07/06 (水) 19:28:12 - dsc > 単一分子ならちょっと不思議じゃないですか。600と634の2本鎖DNAから得られるへテロなDNAは2種類ですよね。 またまた言い方が悪く、すみません。そうですね。2種類です。ただ、そのようにして2種類のhetero duplexが生じているとしたら、アガロースゲル上ではよほど塩基組成や配列に偏りがない限りsingle bandで現れますよね？　強調したかったのは、長さの異なる両者が増える条件でのみ中間長の位置にシャープなバンドが現れているということです。なんだか、おおさんとやり取りを繰り返しているうちに、私の質問の恣意的さ加減に嫌気がさしてきましたが、、（笑）

(無題) 削除/引用 No.617-7 - 2011/07/06 (水) 18:11:38 - おお >[Re:6] dscさんは書きました : > 説明不足だったかもしれません。現行の伸長時間は60secで、正常ホモや変異ホモの個体の結果では、それぞれ約600bpと+34bpの増幅産物がきっちり観察されるので、ヘテロの場合も中途半端に伸長したプロダクトの影響はないと考えています。また、中間長付近に現れるバンドはシャープなので、単一分子種と考えています。 中途半端なプロダクトが次のサイクルでテンプレートに結合して伸長反応をおこすと、変なプロダクトができやすいのではと申し上げています。この場合ホモでは何ら問題ありません。 単一分子ならちょっと不思議じゃないですか。600と634の2本鎖DNAから得られるへテロなDNAは2種類ですよね。 ただたしかに60sは600bpなら十分かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.617-6 - 2011/07/06 (水) 14:26:32 - dsc 説明不足だったかもしれません。現行の伸長時間は60secで、正常ホモや変異ホモの個体の結果では、それぞれ約600bpと+34bpの増幅産物がきっちり観察されるので、ヘテロの場合も中途半端に伸長したプロダクトの影響はないと考えています。また、中間長付近に現れるバンドはシャープなので、単一分子種と考えています。

(無題) 削除/引用 No.617-4 - 2011/07/06 (水) 13:59:49 - おお >[Re:3] dscさんは書きました : > おお様　ご回答ありがとうございます。既に生じている2種のPCR産物（34bpの挿入だけが異なる）の片側鎖どうしの対合を想定しているので、変性時間や伸長時間の操作で抑えることが可能かは「？」ですが、 伸長時間を伸ばすのは反応を完全に行い途中まで伸びた中途半端なプロダクトをさけるためです。そういうものが再アニーリングすると変なプロダクトが増えると思いませんか?

(無題) 削除/引用 No.617-3 - 2011/07/06 (水) 09:41:45 - dsc おお様　ご回答ありがとうございます。既に生じている2種のPCR産物（34bpの挿入だけが異なる）の片側鎖どうしの対合を想定しているので、変性時間や伸長時間の操作で抑えることが可能かは「？」ですが、確かにサイクル数を減らせば見えなくできるかもしれませんね。今までは増やすこと前提で35cyclesでやっていましたので。アニーリング温度への降下にslopeをかけるのも効果があるかもしれないと思いました。 同じような「hetero duplexの形成による中間長のPCR産物らしきもの」が現れた経験のある方がおられないかな、と思って投稿したのですが、いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.617-2 - 2011/07/04 (月) 16:20:35 - おお その可能性はまあまああると思いますが、それだけではなんともいえません。 ヘテロを抑えるには伸長反応を長めに取る(その長さだと60s-90s)。変性の時間も長めに取る(-60s)。サイクル数を最小限にとどめる。などかなぁと想像します。

組換えマウスの判別 削除/引用 No.617-1 - 2011/07/04 (月) 09:45:14 - dsc ある遺伝子の変異ノックインマウスの繁殖と仔マウスのジェノタイピングを行っています。 変異アレルにはintronにloxが挿入されているので、それを挟む位置のプライマーでPCRをかけ、PCR産物（約600bp）の長さの違い、つまりloxあり/なしによる34bpの差でジェノタイプを決定しています。 約600bpで34bpの差なのでこれまで気づかなかったのですが、高濃度のアガロースゲルで分離し泳動結果をよくみると、ヘテロマウス（のはずの個体）の結果ではどれも、正常アレル由来の約600bpのバンドと変異アレル由来の+34bpのバンドとの間にちょうど中間くらいの長さ（+17bp?）のバンドもあり、計3本の近接したバンドがほぼ均等な濃さで現れています。 正常ホモや変異ホモの個体の結果では、それぞれ約600bpと+34bpのシングルバンドしか現れません。 中間の長さのバンドは、正常アレル由来と変異アレル由来のPCR産物のhetero duplexかなと思いますが、それで正しいでしょうか？　同じような経験をされた方はおられますか？

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