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(無題) 削除/引用 No.8-7 - 2011/02/13 (日) 09:25:53 - Belsize+park 皆様、お返事ありがとうございます。長年のもやもやが吹き飛んだ感じです。経験に基づく話、抗体を作成されているかたのお話など、大変勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8-6 - 2011/02/13 (日) 01:43:06 - T 補足ですが、通常の細胞表面マーカーはせいぜい数千-１万分子/細胞とかが普通ではないでしょうか？この場合、サブマイクログラムの抗体を入れているので、細胞に吸着されて抗体が消費され尽くされることはありません。それが細胞数にあまり依存しない理由です。ただ、細胞数が多くなるとペレットボリューム、洗浄液の持ち込みが増えるでしょうから、ケチケチ使用していると、細胞数で染色強度がふらつく原因になります。

(無題) 削除/引用 No.8-5 - 2011/02/13 (日) 01:40:23 - T FACS抗体を作っている会社でモノクロ作りを担当しているものです。 FACSの抗体は、濃度が第一です。リンパ球の場合は10^7くらいまでは細胞数はほとんど影響ありません。BDのあのデータシートの書き方は、おかしいと思います。でもほかは100 ulで染めることを前提にって書いてあると思います。じゃあ、50 ulでやったら使用量は半分でいいのかと言われたら、その通りです。ただし、洗浄液の残りが人によってまちまちですから、売る方としては100 ulでやってもらわないと安定性を保証できないとかいう気持ちはあるかもしれません。 データシートも「過剰にいれとけばいいんだよ」というつもりで書いているのかと思うのもままみられます（とくに古くからある抗体とか）。ちゃんと検定している商品も、トラブルがないようにかなり余裕を持たせて使用量を記載しています。節約志向なら、自分で検定するのが一番です。

(無題) 削除/引用 No.8-3 - 2011/02/12 (土) 15:49:29 - HIH 結論を言いますと、抗体のクローンや測定したい分子の発現量によると思います。 もちろんデータシートには細胞数辺りの抗体量を記載していますが、私達はいつも測定に使用する細胞数で最初に条件検討を行い、希釈倍率を決定します。その後、細胞数を変えてみると蛍光強度が細胞数に従って変化するものもあれば、まったく変わらないものさえあります。 つまり検討してみて問題なさそうであれば気にする必要はありません。 ただ、比較したい場合はできるだけ細胞数を一定にして測定するべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8-2 - 2011/02/12 (土) 11:57:48 - Actias ああ、そういうものなんですね。 考えてみれば、細胞の光り方を手がかりに細胞を数える装置ですから、細胞の光り方をいろんな抗体間で同じにするなら、細胞表面にくっついている抗体（発色団）の数を揃えないといけないのでしょうね。 でも、濃度が関係ないとは思いません。 湯飲みと風呂桶に同じ数の細胞と同じ分子数の抗体を入れて、「同じ」条件とはいわないですから（極端な話)。 経験者の答えを待ちましょう。

フローサイトメトリー　抗体に関して 削除/引用 No.8-1 - 2011/02/12 (土) 08:53:28 - Belsize park flow cytometryをはじめたばかりの初心者です。基本的なことかもしれず、大変恐縮ですが、どなたかお答えいただければありがたいです。 flow cytometryに使用する抗体のdata sheetをみると、推奨する濃度？が1E+06個の細胞に対してXug（その細胞を懸濁しているbuffer量に関しては記載なし）、あるいは１E+06個の細胞を100ulに調整したものにXugなどといった記載が多いように思われました。つまり濃度ではなく、細胞数に対する抗体総量といった書き方です。 今まで組織、細胞免疫染色、ウエスタンをやってきて抗体を取り扱う感覚からすれば、希釈濃度しか気にしたことはありませんでした（切片が大きい、染める細胞が多い、蛋白量が多いからといって、希釈濃度を変えたりしないですよね）。 なぜflow cytometryではこのような書き方をするのでしょうか。 たとえば１E＋06個の細胞にXugと書かれていた場合、懸濁しているbufferの量は関係ない（つまり抗体濃度は重要でない）ということなのでしょうか。 あるいは１E+06個の細胞を100ulに調整したものにXugと書かれていた場合、1E+05個の細胞を100ulに調整したならば使用する抗体量はX/10ugにするということでしょうか。 むろんtitration assayが大事なのはわかっていますが、どなたか教えていただけないでしょうか。

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