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red/et recombination トピック削除
No.885-TOPIC - 2011/09/07 (水) 13:18:57 - aaa
初めて質問させていただきます。

現在、counter-selection BAC modification kit(GENE BRIDGES社)を用いて
BACの組み換えを行っているのですが、rpsl-neoカセットを目的のコンストラクトに置き換えるステップにおいて、ネガティブコントロールから大量のコロニーが生えるという状況で困っています。
抗生物質の濃度を上げても結果は変わりませんでした。

どなたか同じような経験をされた方はいらっしゃらないでしょうか。
　
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(無題) 削除/引用
No.885-4 - 2011/09/07 (水) 20:39:15 - aaa
回答ありがとうございます。


ネガコンにはrpsl-neoがインサートされたＢＡＣベクターと相同組み換えに必要なpRED/ETプラスミドが入っています。アラビノース無しのネガコンとＰＣＲ産物無しのネガコン両方でやりましたが、結果は同じでした。

ステップ２といいますと、rpsl-neoカセットに組み換えるステップのことでしょうか？
この確認はコロニーＰＣＲとストレプトマイシン感受性のテストで行っています。
確認に用いるプライマーは、ＢＡＣの中に挿入されていないと増幅しないように設計したので、元のテンプレートが入ってきているわけではないと思います。

ストレプトマイシン感受性のテストはrpsl-neo導入後のコロニーをLB broth1.5ml(クロラムフェニコール/テトラサイクリン/カナマイシン加)で
30℃　4時間　培養 した後に、ＬＢプレート（クロラムフェニコール、ストレプトマイシン加）に白金耳でストリーキング後、37℃ over night
翌日、コロニーが生えていないことを確認し、次のエレクトロポレーションへ
という流れです。
培養中にrpsl-neo カセットが抜けたり、変異が入った大腸菌が増えているのではとも考え、LB brothで一晩培養後の培養液で、同じストレプトマイシン感受性のテストを行ってみたところ、やはりコロニーが生えてきました。

エレクトロポレーション前の培養の過程でなぜかストレプトマイシン感受性から耐性へと変化した大腸菌が生じているようです。

(無題) 削除/引用
No.885-3 - 2011/09/07 (水) 16:19:51 - た
ふつうのRed-ET　recombinationを使っていくつかコンストラクトを（ノックインマウス用ですが）作ったことがあります。

Negative controlとはアラビノースなしのコントロールですか？

その場合は、ホモロジーアームが短すぎて、neoカセットのランダムインテグレーション（のようなこと）が起こっている可能性があります。

マニュアルを信じると、５０〜８０ｂｐ程度のアームで十分「効率の高い」組み換えが起こせることになっていますが、理想的には３〜４００ｂｐ付加が理想（私の場合は必須でした）です。

短いアームでは、ＢＡＣのどこか（これは入りやすい場所があるらしく、何故かはわかりませんが）に入ってしまうらしく、アラビノースnegのプレートで多くのコロニーが出ました。

または、~さんのように環状ＤＮＡのコンタミでしょうか。この場合は、ＰＣＲ産物にＤｐｎIを混ぜて３０分ほど前処理（ＤｐｎＩは、ほとんどのＰＣＲバッファーでそのまま使えます）すれば環状ＤＮＡが分解されます。

でも、このキットでは、もともと直鎖上のカセットを増やすのじゃなかったでしたっけ？

(無題) 削除/引用
No.885-2 - 2011/09/07 (水) 15:01:31 - ~
その生えてきたコロニーにはどういうベクターが入っていたのですか？
また、ステップ2の確認はどのようにしましたか？

Counterselectionの無い系ですが、PCR産物に元のベクターがコンタミしていて、
たくさんでてきたコロニーを当たりだとぬか喜びしたことがあります。

red/et recombination 削除/引用
No.885-1 - 2011/09/07 (水) 13:18:57 - aaa
初めて質問させていただきます。

現在、counter-selection BAC modification kit(GENE BRIDGES社)を用いて
BACの組み換えを行っているのですが、rpsl-neoカセットを目的のコンストラクトに置き換えるステップにおいて、ネガティブコントロールから大量のコロニーが生えるという状況で困っています。
抗生物質の濃度を上げても結果は変わりませんでした。

どなたか同じような経験をされた方はいらっしゃらないでしょうか。
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