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対比染色 トピック削除
No.888-TOPIC - 2011/09/07 (水) 19:34:35 - グリーン将軍
Takaraのキットを使ってTUNEL染色をしました。

キット付属のプロトコールに「対比染色はメチルグリーンで」と書いてあったので、3%メチルグリーンに15分間浸し、流水洗浄後、脱水処理として100%エタノール3分×2回→キシレン5分×2回としました。
しかし、グリーンまで脱色されてしまい核がまったく染まってませんでした。

キットのプロトコールシートにも100%エタノール洗浄後に脱水処理(100%エタノール→キシレン)と書いてあるのでそのまま信用したのですが、浸ける時間が長すぎるのでしょうか?ジャブジャブと数回つけるくらいの方が良いのでしょうか?

御経験ある方、よろしくお願いいたします。
 
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ありがとうございます 削除/引用
No.888-3 - 2011/09/11 (日) 10:50:00 - グリーン将軍
tani様

詳しいアドバイスありがとうございます。
完全乾燥させてからという発想はありませんでした。
試してみます。

> 実際に顕微鏡で観察する分についてはヘマトキシリンでも充分に陽性細胞と陰性細胞の区別はつきます。


実際Ki67の時はDABにもかかわらず、ヘマトキシリンを使用していたので問題ないとは思っていましたが、プロトコールシートに載っていたのでそのまま信じてやってしまいました。



写真を撮るときは、デジタルでカラーを使用していますし最近の雑誌で白黒指定というところもないでしょうから、その辺はあまり深く考えていませんでした。

ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.888-2 - 2011/09/11 (日) 10:32:11 - tani
レスがないので参考までに

もし、途中までメチルグリーンが染まっているのでしたら、たとえばアルコールに入れる前まで、とか100%アルコールに一回程度までなら色が落ちていない状態ならば、そこで水なりアルコールなりからスライドを取り出して室温なり、扇風機なりで完全に乾燥させて下さい。
そして封入のためにキシロールに一回浸けて通常通り封入してください、それで色落ちは止まるはずです。裏技というほどの事では有りませんが。

メチルグリーンを核染色につかうようになったのは免疫染色の時の、特に核に発現するものの
ような場合に、DABの色と、核染色の色がかぶらないようにするためです。ですから色がかぶらなければヘマトキシリンでもかないません。実際に顕微鏡で観察する分についてはヘマトキシリンでも充分に陽性細胞と陰性細胞の区別はつきます。

ただ問題なのは写真に撮る時です。いまはあまり使いませんが、投稿用に白黒フイルムで写真を撮っていた当時はヘマトキシリンはDABの色とかぶり使えませんでした。じゃメチルグリーンはいいのかといいますと、そのままでは使えず顕微鏡のフイルタにグリーン色を使って写すとプリントしたときにグリーンの色は消え陽性部分しか写っていません。

ですから、カラーが主流の現在は対比の核染色はヘマトキシリンでもメチルグリーンでもどっちでもいいです。おそらくは白黒写真当時のなごりか、まだモノクロ写真を必要としている人がいる前提でメーカーはメチルグリーンを推奨しているのかと思いますよ。

じゃ、メチルグリーンの染色標本をデジタルカメラでグリーンフイルタを入れてその画像をモノクロかグレースケールに変換したら同じじゃん、という考えもありそうですが、やったことはありませんがそうはならないと思います。

対比染色 削除/引用
No.888-1 - 2011/09/07 (水) 19:34:35 - グリーン将軍
Takaraのキットを使ってTUNEL染色をしました。

キット付属のプロトコールに「対比染色はメチルグリーンで」と書いてあったので、3%メチルグリーンに15分間浸し、流水洗浄後、脱水処理として100%エタノール3分×2回→キシレン5分×2回としました。
しかし、グリーンまで脱色されてしまい核がまったく染まってませんでした。

キットのプロトコールシートにも100%エタノール洗浄後に脱水処理(100%エタノール→キシレン)と書いてあるのでそのまま信用したのですが、浸ける時間が長すぎるのでしょうか?ジャブジャブと数回つけるくらいの方が良いのでしょうか?

御経験ある方、よろしくお願いいたします。

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