| ラミンって核膜のうらのくっついてるあれだな？。あれはけっこう試料調製中とかにプロテアーゼで分解されやすいよ。超音波はいい感じで温かくなるから、緩いライシスバッファー中でやってると酵素とかがいろいろよろしくないことしそうだな。proteinase inhibitorをいろいろしっかり入れるとか,レムリーバッファーで細胞溶かすとかしたほうがいいかも。またいま使ってる抗体が果たして信用に足るものかどうかも問題だな。もちろんしれがIPにも使えるかどうかも大事だけどね。出来ることならもう一つ二つ別のメーカーから買ってみたらどうよ。もし抗体が原因ならその間の祖試行錯誤はほぼ徒労に終わるからこれは痛いから。それとあれだ、coIPの話だけどまず使ってるライシスバッファーが核膜を可溶化できるやつでないとやっぱだめだ。超音波はDNAとか切ったり、膜をズタズタにはするので確かにそのすごさは認めるけど、基本あれはたんぱく質を溶かすためのものじゃないから、やっぱ溶けなきゃ遠心したら下に行くよ。それでじゃあ何使えばいいんだよということだが、NP-40とかTritonは基本的に核はあんまり影響しないからこれはまず候補から外すということで、IPにも適用できそうでかつ核膜溶かすということだとたとえばデオキシコール酸ナトリウム(DOC)とかCHAPSとかそのへんをいれるといいかな。というかRIPA bufferどうよ、DOC入ってるよ。CoIPだとこれら中途半端に強い界面活性剤が複合体を解体させるリスクはあるけど、まあとりあえず、自分的には、IPしてラミンとれてくるか見て（まずこれが確認できることがこの実験の大前提だな）、それを確認してから条件を段階的に緩めて可溶化能と複合体安定化の妥協点さぐるという戦略かな。あとEDTAは入れた方がいいよ。Mgキレートして核膜不安定化して核膜の破壊をたすけるとおもうので。それとIPってバックグラウンドが結構多くて、CoIPしてもCoIpできてても量的にマイナーなものだとそういうのに隠れてしまい見えなくなることもすごく多いよ。できるだけよけいなものを持ち込まないように、たとえば核フラクションに分画してからIPするとかしたほうがいいかもね。 |
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