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発現あるかも 削除/引用 No.978-4 - 2011/09/28 (水) 13:46:49 - s 癌細胞といっても、上皮系の癌は発現してたりしますよ。 Tリンホーマでも発現するものもありますし。 アイソタイプがずれるのであれば一度FcR発現をチェックしてみるといいかもしれません。 それで対策が取れれば、flow joさんの問題も解決されるかもしれない訳ですし。 Voltage/Conpensationについては２サンプルで別のセッティングにするということではありません。 それはだめです。 刺激あり／なしのisotype染色サンプルを用いて、両サンプルの蛍光強度が同じようになるセッティングを探すということです。 単染色もしくは干渉しない蛍光の組み合わせでは無理ですが、PEとFITCのようにconpensationが必要な蛍光の組み合わせでは、場合によってはflow joさんのサンプルのような現象は改善できることもあります。 ただ、FcRの発現を確認していないということであれば、こちらのほうが原因のような気がします。 あと、細胞が活性化して膨潤していることから考えると、染色の際に細胞が細胞外液を飲作用のようなもので多少取込んでしまっていることもあるかと思います。 そうであれば、染色前、染色中もしっかり細胞を氷上で冷やしておけば、ある程度取込みを抑えられると思います。 あるいは細胞を固定してしまうとか。

ありがとうございます 削除/引用 No.978-3 - 2011/09/28 (水) 12:49:00 - flowjo >s様 御返信をどうもありがとうございます。 私がFACSで見ているのは癌細胞のため、 FcRがないと思いますので Fc blockはしておりません。 見ているものも穴あけFACSではなく 細胞表面です。 ただ、 刺激有り／無しのサンプルでFLのvoltageやconpensationを調整することで、ある程度２サンプル間のisotype MFIを揃えることはできます。 については、 刺激後のサンプルでアイソタイプコントロールがどうしても動くときは 刺激したサンプルを無刺激サンプルのvoltageの値と合うように 動かしても大丈夫なのですね。 (恣意的になるので今まで動かしませんでした)

Fcブロック 削除/引用 No.978-2 - 2011/09/28 (水) 11:14:03 - s しっかりFc受容体はブロックしていますか？ 抗FcgR抗体を用いてブロック、もしくは用いている細胞がマウス由来であればunconjugated mouse anti-KLH (isotype: IgG1) でブロックするなどの方法がありますが。 FcブロックしててもisotypeのMFIが動くのであれば、刺激有り／無しのサンプルでFLのvoltageやconpensationを調整することで、ある程度２サンプル間のisotype MFIを揃えることはできます。

培養細胞に薬剤処理した時のFACSでの解析 削除/引用 No.978-1 - 2011/09/26 (月) 23:01:00 - flowjo いつも拝見させていただいております。 今回、培養細胞に薬剤(抗癌剤)処理した際に 培養細胞上のタンパクの変動をFACSのMFIの動きで見ました。 その際、薬剤によっては、 培養細胞の形状が変わって大きく膨らんだりします。 その際、FACSでも薬剤添加群でFSC-SSCが大きくなり、 そしてFL1,FL2の各分子もそれにつられ 発現強度が大きくなります。 (voltage,compensationはポジコンで合わせて、 薬剤添加、無添加では一切動かしていません) 薬剤添加群のアイソタイプコントロールサンプルは 薬剤無添加群のアイソタイプコントロール群と比較して MFIが3⇒6になったり、ひどいときは3⇒10となり、 target分子で染色、反応したものはそれにつられ薬剤添加群で 大きく動きます。 ヒストグラムで明らかに薬剤添加群のアイソタイプコントロールが薬剤無添加群と比較して動いていると分かります。 そのまま、MFIを棒グラフで出すと target分子は明らかに動いていると思いますが、 アイソタイプコントロールも動いているので解析しづらいのです。 そのため解析は 薬剤無添加群と薬剤添加群ごとに target分子のMFI/アイソタイプコントロールのMFIで計算し 薬剤添加によって 変化があるかどうかで行いました。 しかし論文ではMFIを出すときに target分子のMFI/アイソタイプコントロールのMFIで出したグラフは見たことがありませんし、見たことあるものは target分子のMFIで薬剤添加によって 変化がありましたとか アイソタイプコントロールと並べて棒グラフに載せてあるもの かあるいはヒストグラムで変化を視覚的に出しているのを 見たことしかありません。 薬剤添加したものをFACSで解析するとき、 やはり形状があまりにも変わるものと変わらないもので 比較はできないのでしょうか。 また、皆様は薬剤添加によってtarget分子が動いたかどうか 例えばFACSで見るときにどのように解析されているのでしょうか。

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