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(無題) 削除/引用 No.674-14 - 2011/07/19 (火) 09:41:25 - ppp 経験上、例えば、p何々みたいな分子量を元に名付けられたタンパク質でもズレます。 使っているマーカーの種類、PAGEの濃度、サンプルの調整方法等、様々な要因が絡み合ってくるのでしょうが、ズレます。 加えて、この場合は名付けたモン勝ちみたいな所も有りますからね。

(無題) 削除/引用 No.674-13 - 2011/07/19 (火) 08:50:58 - ~ Pre-stainedの影響もあるでしょうけれども、そもそもSDS-PAGEでは移動度と分子量は相関は高くても多少のずれはあります。 そのため、”データシート状の分子量”と、”適当なマーカーの検量線から計算された分子量”が一致することはありますが、一致しないからといって分子量が違うとはいいきれません。

(無題) 削除/引用 No.674-12 - 2011/07/17 (日) 12:20:24 - yoko BBBさん 大変詳しい返事を有難うございます！ 参考にさせて頂きます。

Pre-stained markerは目安 削除/引用 No.674-11 - 2011/07/16 (土) 12:17:47 - ats Pre-stained markerをお使いなら、先に開示しないと...。 Pre-stained markerはタンパク質を色素で修飾しているものがほとんどなので、電気泳動のゲル・bufferによって見かけの分子量が変わるので目安くらいに思っていた方が良いですよ。 特に低分子のバンドは顕著なような。また、一昔前はロット間で数kDa以上分子量が異なっていました。 最近のものは割とシャープなバンドが得られますが、それでも未修飾マーカーに比べれば太い（＝単一でない）ですし。

６７４−７の人へ 削除/引用 No.674-10 - 2011/07/16 (土) 06:13:29 - BBB リン酸化：ほんの少し上にズレることがある。バンドがダブレットに見える（論文見てください）。 糖鎖：上にズレたり、シグナルがボーッした感じだったりスメアっぽくなったりする。ただ糖鎖の構成によっては本来のコア蛋白質の分子量より下になる事もある。 ユビキチン化：上に出る。ポリユビキチン化フォームならゲルの一番上あたりから高分子量領域にスメア状になる。SUMO-2／3化なども同様。明瞭なバンドはみえにくい。モノユビキチン化フォームなら本来の分子量プラス10Kくらいに弱いシグナルが出る。SUMO-1化なども同様。 アミノ酸の偏り：強塩基性蛋白質の場合プラス荷電が極端に多いため、移動度が遅くなり、SDS-PAGEでは本来の分子量よりも（ときにはかなり）大きい位置に来る。 その他、強疎水性蛋白質なども理論値とはことなる異常な分子量を示す事がある。 その他、還元処理の有無で、分子内S-Sの切断状況によっては同一蛋白質でも移動度が変化することがある。 いずれにしても個々の蛋白質によりケースバイケースな所も多分にあり、一概に、こういうときはこれだ、みたいにに断言はできないです。あくまで一般的な傾向として参考にしてください。SDS-PAGEは比較的正確に分子量を見積るうえで、きわめて簡便で有用な方法ですが、やはりいろいろ限界もあります。

(無題) 削除/引用 No.674-9 - 2011/07/16 (土) 01:28:19 - z 多数のご回答、有難うございます。 ＾様、おお様、 私が、文献(あるいはData sheet)と記載したので、混乱させてしまいました。今回私が思っていた蛋白の分子量とは、Data sheetに数値として具体的に記載されてあるものでした。Western blottingでこの蛋白を検出している文献を、今回初めて探しましたが、見当たりませんでした。よって、多数ご指摘されている様に、修飾などにより、その理論値とは異なる分子量が出ても、おかしくないという事で宜しいでしょうか。 えfw様 今回使用した組織にはその蛋白が発現しているはずであり、それがポジコンとなるべきものと考えています。今回は、その確認でした。ネガコンは置いています。 ABZO様、KY様 分りやすく丁寧なご回答、誠に有難うございます。本物か偽物かの確認もする様に致します。 おお様 マーカー測定と書いたのは、マーカーを指標にして、目的の蛋白の分子量を見積もったという意味でした。 ンンノ様 今回、私が使用したのはちょうどカラーマーカーでしたが、色素がついている分だけ分子量が大きくなっているという事は、例えば100kDと記載されてあるカラーマーカーのバンド位置があるとして、ハダカのタンパクがそれと同じバンド位置にあれば、それは実際100kDより大きい（数kD程度？）という事でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.674-8 - 2011/07/15 (金) 10:20:50 - ンンノ ウェスタンでカラーマーカーがよく使われますが、あれは色素がついてるぶん だけ分子量が大きくなってるので、バンドの位置がハダカのタンパクより上に なります。

(無題) 削除/引用 No.674-7 - 2011/07/15 (金) 08:32:44 - yoko 横からの質問ですが、 〜アミノ酸組成の偏りやリン酸化とか糖とかユビキチン化,末端部分の 限定分解とかのような修飾など〜 この様に分子量が変わる時って、増える場合と減る場合があるのでしょうが、どういう時に増えて、どういう時に減るのでしょうか？ また、増える場合と減る場合で、皆さんの経験上、どちらが多いものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.674-6 - 2011/07/15 (金) 00:56:15 - ABZO SDs-PAGE/WBで分子量が理論値と異なる事はそんなに珍しい事ではないよ。アミノ酸組成の偏りやリン酸化とか糖とかユビキチン化,末端部分の 限定分解とかのような修飾などいろいろな理由で。組織や細胞が違えばそういうのも違うから文献のデータと合わなくてもかならずしもおかしくないし、それ自体、予想外のノイエスである可能性もある。でも幻を追ってしまうとやはり痛いのでとりあえず 大事な事は、今みているシグナルが本物か偽物かを早めにはっきりさせておくことだ。つまり、RNAiで発現抑えて、そのシグナルも減弱するとか、リコンビナントとか（部分ペプチド抗原で免疫したものでデータシートに部位が書いてあればその）抗原ペプチドを1次抗体反応時に添加して、競合的にシグナルが消失or減弱するとかの実験を一度やっとけばいいとおもう。そうしておけばだれかが分子量なんか違くない？とかいってきたら、ホレとそのデータ見せて終わり.　もしどうも怪しそうなら、いまの抗体にはあんまり固執せず、すみやかに別の抗体買い替えてやり直すのがいい。 これは昔聞いたはなしで経験はないけど、マーカー自体もロットなどによっては多少分子量ズレる事あるらしいよ。

(無題) 削除/引用 No.674-5 - 2011/07/14 (木) 16:54:54 - KY もし過剰発現などをポジコンとせずに、ライセートを抗体で当てただけのバンドのみの観察であれば、それが一番濃いバンドでも本物であるかどうかはわかりません。 経験的に、購入した抗体の目的バンド付近にちゃんとしたバンドがでても、非特異だったことがあります。 また分子量が同じでもタンパクによりアミノ酸電荷の数が違えば、泳動される位置が少し変わることはあります。

(無題) 削除/引用 No.674-4 - 2011/07/14 (木) 14:30:44 - おお >[Re:1] zさんは書きました : 申し訳ないんですが何をやって何がおかしいと思っているのかよく分かりません。 > Western Blottingにて目的の蛋白の分子量が、マーカー測定にて、文献(あるいはData sheet)の分子量と差が出てしまいます。マーカーはBIO-RADのを使用しています。 マーカー測定ってマーカーのMWを何らかの方法で見積もったの?それかマーカーを指標にして何かのMWを見積もったの。で結論としてマーカーがずれているということなの?貴方のタンパクがずれていると思っているの? 文献は何をしてしているの。そのたんぱく質の理論的な分子量。電気えいどうでそのサイズという根拠はどのように提示されているの?マーカーの移動度がバンドと一緒に示されていたとしたらあなたの使ったものと同じ商品を使っているの。同じ商品でもロットで分子量が変わるものであったら微妙ですよね。文献と全く同じサンプルを使ってるの? まあ思ったところのサイズに出ないというのは分るのですが具体性にかけます。 サイズがずれることがあるかどうかは、同じサンプルで同じマーカーをつかい同じ電気えいどうのシステムを使う限り余程無茶なことが起きない限り変わりません。そうでなければなにか違うことがあると考えればいいかと思います。ちがうメーカーの比較でも両者で矛盾があることもありますから。それに加えていまはSDSPAGEのバッファーシステムなども多様化してますから。

(無題) 削除/引用 No.674-3 - 2011/07/14 (木) 13:00:49 - ~ 文献では同じマーカーを使っているのですか？ 移動度は分子量とは必ずしも比例しないので、違うマーカーであれば移動度が違うことはおかしな話ではありません。 >これを目的のバンドと考えても良いのでしょうか。 分子量だけで目的のバンドと考えるのは無理があるでしょう。 他の目的のバンドであることを示唆するデータも欲しいですね。

(無題) 削除/引用 No.674-2 - 2011/07/14 (木) 11:59:31 - えfw あなたが参考にされた論文で使われている細胞にあなたも発現させたのではないのなら、糖鎖修飾とかは細胞ごとで違いますので別に不思議に思う事はないでしょう。 ちなみにポジコンネガコンは当然置いてますよね。

Western blottingでの分子量のずれ 削除/引用 No.674-1 - 2011/07/14 (木) 11:24:04 - z 基本的な事ですが、教えて下さい。 Western Blottingにて目的の蛋白の分子量が、マーカー測定にて、文献(あるいはData sheet)の分子量と差が出てしまいます。マーカーはBIO-RADのを使用しています。 具体的には、ほんの4kD程度の差なのですが、マーカーにある25kDより、少し上に出るべきものが、下に出てしまうので、目立つ形です。 しっかり発現しているので、非特異のバンドではないと思います。 以前のトピックで、この辺りのバンドはずれやすいと書かれてあるのがあったのですが、そういうものなのでしょうか。 何度流しても、同じ位置になるのですが、これを目的のバンドと考えても良いのでしょうか。

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