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(無題) 削除/引用 No.55-28 - 2011/02/23 (水) 10:40:34 - ~ >プローブは500 bpのPCRフラグメント 一番怪しいと思っているのは、プローブが実はNeo耐性遺伝子などで、11kbだとクロスしないものではないかという点です。 プローブはホモロジーアームの片方などでしょうか？ また、11kbが長いために問題になっていると考えているのであれば、例えば11kbを5kbに1cutする酵素でも処理すれば、おそらくは問題は解決しますよね。 そういういい制限酵素認識サイトはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.55-27 - 2011/02/22 (火) 23:46:00 - チャウチャウ >サイズマーカーを一緒に泳動してトランスファーしてると思いますが、サイ ズマーカーでもRIプローブを調製して、一緒にハイブリしてやるとトラン スファーされてるサイズがわかります。 cf. No.55-13

(無題) 削除/引用 No.55-26 - 2011/02/22 (火) 23:02:09 - ンンノ トランスファーの問題ではないような気もしますが、チェックする方法はあ ります。 サイズマーカーを一緒に泳動してトランスファーしてると思いますが、サイ ズマーカーでもRIプローブを調製して、一緒にハイブリしてやるとトラン スファーされてるサイズがわかります。 プローブの比活性を相当低くしないと真っ黒になるので要注意です。

(無題) 削除/引用 No.55-25 - 2011/02/22 (火) 22:01:24 - 774 digestする時はトータルボリュームを多く(400マイクロぐらいでしょうか)し、過剰量の制限酵素を加え、6h〜o/n ノックアウトの種類ごとにいちいち酵素のボリュームを変えるのは面倒なので・・・。遺伝子も違えば使用する酵素も違いますし。まぁでも特に問題あったことはないです。 あとは厚めのゲルで30v程度で泳動するといった感じでしょうか。 あんまり特別なにかあるといった感じではないですね・・・

(無題) 削除/引用 No.55-24 - 2011/02/22 (火) 21:30:31 - サザン 774様、 コメント有り難うございます。 30 µgのgDNAを泳動したことはないのですが、多量のgDNAを泳動する際の注意する点等あれば教えて頂けないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.55-23 - 2011/02/22 (火) 21:28:13 - サザン AP様 コメントありがとうございます。　ScaIの短い寿命の件、知りませんでした。 勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.55-22 - 2011/02/22 (火) 21:15:52 - 774 私のラボの系ではgDNA量を変えたとしてもラベリングして使用するプローブは変えていないので、露光時間が長くなればなるほどバックは高くなってしまうのはごく自然なことと思います。 目的のバンドではバックに比べて相対的にシグナルが強いので、露光時間を短くできればバックは低くできる気がします。 つまりさっさと目的のバンドだけ出して、バックが高くなる前に現像してしまうといった感じです。 無理矢理感は否めませんが・・・。

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