全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

皆様ありがとうございました 削除/引用 No.10065-8 - 2021/11/25 (木) 18:58:26 - BlueComma みなさまご回答誠にありがとうございました。 これまでの情報をまとめますと， ・泳動ゲルを転写バッファーに浸漬する行程は必須ではない（無くても事故は起こらない） ・転写バッファーにゲルを漬けておくのは，予めメタノールでゲルを収縮させることで転写中のズレを防ぐことが目的 ・実際にはゲルを軽くすすぐ・セッティング中に転写バッファーに漬けておく程度でOK 大変勉強になりました。今後ともよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.10065-7 - 2021/11/25 (木) 04:24:56 - おお >あれはね、平衡化というか、メタノールに馴ませてあらかじめゲルを少し縮めるのが一番の目的。でないと転写中にゲルのサイズがだんだん縮んできてよくないので。 なるほど、そういう対策もあるのですね。私がやってきた環境ではWetでカセットにスポンジでタイトに挟むので縮んでずれるとこはないようです。たまにTransfer後ろ紙をめくると、その時に縮んで行くのが見れます。

(無題) 削除/引用 No.10065-6 - 2021/11/24 (水) 19:55:38 - G25 大抵のtransfer buffuerはMethanolが入っているけど脱水でゲルが縮むから、置換が済むまではメンブレンに乗せられない。とは言うけど、あんまり意識してやったことない。メンブレンやブロッターのセッティングだとかやっている間、よんどころなくほっとかれているだけという感じ。段取が良くてすぐ乗っけることになっても事故になった記憶はない。 tank blotかsemidryかでも違うかもしれないし、transfer bufferにSDSが入らない系か入る系かでも違うかもね。 SDSを含むバッファーだと通り抜けるタンパク質があったり、電気抵抗が下がっていつもより余計に電流が流れたりするんだけれど、 せっかく抜きのバッファーでやっても、ゲルにSDSが残っていると、その影響で予期せぬことが起こることも（標的タンパク質のスっぽぬけ、過熱、装置の電気容量オーバーなど）。

(無題) 削除/引用 No.10065-5 - 2021/11/24 (水) 17:04:30 - ふ あれはね、平衡化というか、メタノールに馴ませてあらかじめゲルを少し縮めるのが一番の目的。でないと転写中にゲルのサイズがだんだん縮んできてよくないので。 時間は厳密に測ってないですが、少なくとも5分もやれば十分です。

(無題) 削除/引用 No.10065-4 - 2021/11/23 (火) 03:22:21 - おお 特にやってません TRIS-GLYCINEの場合はとくに。ゲルのフラグメントが乗ってたりするのでRO水蛇口から弱い水流で流した水ですすぐことはあります。 TRIS-TRICINEなど特にバッファー濃度が高いようなときはメタノール抜き、０．１％SDS入ですすぐぐらいですぐにトランスファーにセットします。１、２分もしてないです。でもたまにどのバッファーシステムで泳動したか意識せず、すぐにトランスファーにセットすることがあります。 バッファー成分など小さい分子は浸透が早い。たとえばPAGEで流したDNAなんかエチブロ溶液に１分もつけておくとしっかり染まっている。 メタノールにタンパク変性、固定効果があるのであまりトランスファーバッファーで平衡化するのは個人的な話かもしれませんがおすすめしません。

(無題) 削除/引用 No.10065-3 - 2021/11/23 (火) 02:05:42 - sss 私は特にやっていません。すぐ転写しています。

参考資料です 削除/引用 No.10065-2 - 2021/11/23 (火) 01:52:53 - BlueComma ・「15分未満」 ttps://www.atto.co.jp/content/download/3815/44930/file/%E3%82%B1%E3%83%9F%E3%83%AB%E3%83%9F%E3%81%AE%E3%82%B3%E3%83%842020-11.pdf（7ページ目） ・「15分〜30分」 ttps://www.technosaurus.co.jp/pdf/Boster_Western_Blotting_Troubleshooting_Handbook_J1704.pdf（22ページ目）

ウェスタンブロット，転写前のゲル洗浄について 削除/引用 No.10065-1 - 2021/11/23 (火) 01:51:25 - BlueComma いつも勉強させて頂いています。 ウェスタンブロットの転写前にSDS-PAGE後のゲルを転写バッファーで洗浄（平衡化？）するステップを，皆様はどれくらいの時間でされていますか？ メーカーのプロトコルを調べていたら，「15分未満」や「15分〜30分」とするものがあり，どちらがいいのか分からなくなりました。ご教授頂けますと幸いです。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---