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(無題) 削除/引用 No.10071-8 - 2021/11/30 (火) 16:57:00 - k SDSで抽出してたとしても、脂質の層にも一部の脂溶性蛋白質がある可能性はあるかもしれないので、その層を避けてサンプルとすると、最初の段階ですでに人為的なバイアスが入る気がする。

(無題) 削除/引用 No.10071-7 - 2021/11/29 (月) 21:07:01 - nana 皆様ありがとうございます。 > 1000(とか5000ul)チップも使えるぐらいの容器なら、 > 左手で保持した先端カットチップでどかして、そのチップの内側に > 採取用チップを入れて、ピペッター(右手使う)で吸うというやり方も > あるかも知れない。長さによっては、パスツールピペット。 この方法はチップの外表面に付着する脂肪を減らせそうなのでぜひ試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10071-6 - 2021/11/28 (日) 10:20:45 - おお http://www.biotechsupportgroup.com/v/vspfiles/templates/257/pdf/CleanasciteProduct%20Sheet031220MK.pdf https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge80648470?context=product そういうためのキットがあるようです。Cytivaのほうは多分有機溶媒とかTCAなどでタンパクを沈殿させる方法を応用しているのかなと思います。サンプルバッファーくわえて黄色になるとか書いているから多分TCAかな。このキットはわからないけど沈殿させる場合リカバリーが安定しないこともあるのでどうかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.10071-5 - 2021/11/28 (日) 07:47:50 - あの どの程度の脂質の混入を許容できるかとか、 タンパクは何に使う目的かにもよると思います。 そもそも水層にみえるろころにも、溶解した脂質が 存在します。そのため完璧目指すなら、そふぇなりの 脂質除去のプロトコルが必要。 でも、 サンプル数があまり多くなくて、完璧でなくても良いなら、 (1)口径の広い容器の方が良いような気がする。 (2)チップ一本ですまそうとせず、 水面の浮いているものをどかすためのチップと、 水層の採取用のチップを分けた方が良い。 吸引力の弱い、容量の小さいピペットに、長いチップつけて、 ゆーーーくりすう。 先端を料理用ハサミ(の付け根側)で切った、チップの方が よいかも。 1000(とか5000ul)チップも使えるぐらいの容器なら、 左手で保持した先端カットチップでどかして、そのチップの内側に 採取用チップを入れて、ピペッター(右手使う)で吸うというやり方も あるかも知れない。長さによっては、パスツールピペット。

(無題) 削除/引用 No.10071-4 - 2021/11/26 (金) 20:35:18 - nana ありがとうございます。 サンプルバッファーはSDS-PAGE用のものでラボにあるものを使っております。 そのままロードできる形です。

(無題) 削除/引用 No.10071-3 - 2021/11/26 (金) 20:12:04 - G25 サンプルバッファーとは？ それはSDS-PAGE のサンプルバッファーということで、直接、ゲルにロードしようとしているというシチュエーションですか？

(無題) 削除/引用 No.10071-2 - 2021/11/26 (金) 19:51:36 - み 10万g以上で１時間要するに超遠したら脂質は沈殿するかも。 14000rpmなら2万g程度ですか。上清の透明度からして全然違うよ。

マウス肝臓からのタンパク抽出 削除/引用 No.10071-1 - 2021/11/26 (金) 18:25:17 - nana いつも拝見させていただいております。 マウス脂肪肝組織からの全タンパク抽出を行っているのですが、 サンプルバッファー内で組織を溶解したのち遠心（14000回転、20分）をすると、 表面に脂肪層、底に残渣のペレットができるのですが、 上手く真ん中の水層を分離できません。 現在は、脂肪層は処理せず、チップをそのまま水層に入れ吸引し、 新しい1.5mlチューブに吐き出していますか、 その際にチップの外表面についた脂肪が混入してしまいます（サンプルが少し濁る）。 また、もとのチューブの水層に一度チップを入れてしまうと、その際にも脂肪が多少水層に入り濁ってしまいます。 サンプルが大量にあれば、攻めずに水層の一部を吸って1回きりで済ますのがよいものと思いますが、サンプル量が限られておりできるだけ多く収量を得たいと考えています。 脂肪をコンタミさせずにうまく水層のみを得る方法がございましたらご教示いただけますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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