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(無題) 削除/引用 No.10119-10 - 2021/12/23 (木) 19:37:57 - ema 以前のフォーラムですが http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=69

(無題) 削除/引用 No.10119-9 - 2021/12/23 (木) 13:00:31 - SDS 皆様ありがとうございます APSは水に溶かしてすぐ分注して冷凍庫で凍らせており、まだひと月半程度なので古くは無いかとは思います。(解凍したあまりはもう一度凍らせていますが)

(無題) 削除/引用 No.10119-8 - 2021/12/22 (水) 00:46:53 - AAAA 私もAPSが分解？されて固まらないことは時々ありました。 メーカのホームページでは室温保存と書いてるものも多いのですが、経験から一回開けて室温保存だと、数か月でダメになってしまうことが多いです（デジケーター内で室温保存でもダメでした）。 アクリルアミドが固まらない場合は、APSを新しく購入すると、固まるようになることが私は多かったので、APSを新しく購入してみてはどうでしょうか。 一回開けたものは、粉の状態では、湿気が入らないように吸湿剤入れて、密閉（ジプロックやデジケーター）で冷蔵保存ならしばらくもつこともあります。 また、APSを溶かして、1.5mlチューブに分注して冷凍保存しておいたものは、何年か前のものでも使用できました。冷凍庫に余裕があるのなら、冷凍ストックをたくさんつくっておけば、APSの分解で固まらないということはないかと思います。一度溶かしたものは、念のため使い切りで捨てています。

(無題) 削除/引用 No.10119-7 - 2021/12/21 (火) 20:40:50 - FEN APS が古いとかないですか？ 自分の場合は、固まらないことでAPSが古かったことに気付くことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.10119-6 - 2021/12/21 (火) 19:03:34 - SDS 皆様ありがとうございます まとめると、酸素と触れるのを防ぐ コームをきれいにする スタッキングゲル濃度を変えてみる APSを増やす 温める といったあたりでしょうか。 色々試してみます！

(無題) 削除/引用 No.10119-5 - 2021/12/21 (火) 12:49:24 - 寒い ヘアードライヤーで温めてしました。ほんのりと暖かくなるくらい。これで解決でします。

(無題) 削除/引用 No.10119-4 - 2021/12/21 (火) 00:47:48 - おお オリジナルのスタッキングのゲル濃度は３.７５％でたしかにこの濃度は固まりにくいです。いくつかプロトコールを見てみるとそれより濃いプロトコールも見つかるでしょう。 加えて固まらない（にくい）原因の一つが使っている水に含まれる酸素です（これも低温のほうが溶解度が高いのかな、気体だし）。オリジナルのプロトコールでは固まりにくいこともあって、脱気を何らかの方法でしてからAPSやTEMEDを加えるという話はあります。APSの濃度を調整しているプロトコールもあるようですが。 もう一つやれることは、スタッキングのゲルを重層、コームを刺してから、残ったアクリルアミド溶液にさらにTEMEDを加えてゲルを上部から封印してしまうようにして酸素との接触が極力内容にする（コームの形状によりますが）。もとのスタッキング用アクリルアミド溶液のTEMEDも２倍ぐらいに増やしてもいいでしょう。ただし分離用ゲルの作成にはTEMEDを増やさないほうがいいらしいです。 また、大腸菌のインキュベーターなどの中に入れてゲル化を促進するというのもありかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10119-3 - 2021/12/20 (月) 17:42:33 - jklkj Acrylamideの重合反応は温度に依存するので冬場は固まりにくいのです。特に冷蔵庫から出してきた溶液をすぐ使うと冷たいので固まりにくいです。スタッキングゲルはゲル濃度が低いので余計固まりにくいです。なので温度が低すぎない部屋で作業し、ゲル液を混合したらAPSとTEMEDは室温くらいまでなっているのを確認してからいれましょう。ガラス板が汚れていると固まりにくいです。例えば上部はサンプルのwellが来るのでbMEなどの還元剤が残存してると重合を阻害します。普通に洗っていれば問題ないと思いますが。重合するまでの時間があまり長いとどうしてもゲルが変になりwellがうまくできていなかったります。冬場はAPSの添加量を普段の1.5倍くらいにしてみるとか工夫してます。（TEMEDは強アルカリなのであまり変えない方がいいです）

(無題) 削除/引用 No.10119-2 - 2021/12/20 (月) 17:13:21 - G25 コーム周囲で重合が阻害されてるわけですけど、 コームが汚れていたり、古かったりするとそうなるようです。 汚れに重合を阻害する物質が含まれていたりするんでしょうかね。 始めはキズやすり減りで気密が悪くなって空気に触れるから固まらないのかと思っていましたが、ビーカーの中で空気に触れた状態でも、そのうち固まるものですからね。一部分だけゾルのままでのこるって、そういう理由ではなさそう。

Stacking gel 削除/引用 No.10119-1 - 2021/12/20 (月) 17:01:34 - SDS こんにちは SDS-PAGEのスタッキングゲルがうまく固まりません(コームの上の方までゲルが固まらず、穴の深さが中途半端だったりほとんど穴が開いていないような状態になります) ゲル液をよく混和したり、ゲル液を多めに満たしてコームをヒタヒタにしても改善されませんでした。 ランニングゲルを固める→水か水飽和ブタノールで重層する→重層ぶぶんを洗い流してキムワイプでふき取りしばらく乾燥→スタッキングゲルの順で作成しています。

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