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(無題) 削除/引用 No.10158-5 - 2022/01/11 (火) 09:53:00 - TS とおりすがりのものさん、ありがとうございます。 IRES-NEOでも50％いかないくらいなのですね。 CAG、WPREについても検討してみます。 ありがとございました。

(無題) 削除/引用 No.10158-4 - 2022/01/08 (土) 21:58:38 - とおりすがりのもの IRES-Neoでも100％陽性にはなりません。 良くて50くらい 理由はわかりませんが、たぶん開始コドンの認識がずれたり、どこかで配列に傷がはいるため。 線状にしたことはありませんが、環状で入るので、あまりメリットはないと思います。 CMVは結構メチル化されるので、CAG使う人もいますね。やってみないとわかりませんが、発現量高めるためにWPREつけるのも良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.10158-3 - 2022/01/07 (金) 13:51:29 - TS mpさん、ありがとうございます。 プロモーターはCMVでNeoRは別プロモーターです。 30％でも効率が良い方ですか。そのくらいなのですね。 CMVプロモータのサイレンシングは考えてませんでした。 そのようなこともあるのですね。 ご提案の通りは、次（ほかの実験）ではIRES-NeoRを考えていました。 実際にはHygRですが。 始める前に情報があると大変助かるのですが、 IRES-HygRでも100％ポジティブにはならないですか。 プラスミドを線状化しておくと、さらに改善しますでしょうか。 細胞株の都合なのですが、モノクローンはとらずに、ポリクローンで実験をしたいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.10158-2 - 2022/01/07 (金) 13:15:09 - mp 30%というのはそれなりに効率がいいと思いますが、プロモーターがCMVとかだとすぐにメチル化を受けてサイレンシングが進行している可能性もあります。IRES Neoとかにすればぐっと効率も上がるはずですし、仮にサイレンシングを受けてもその細胞は脱落していくので、集団の中での発現も維持されます。

薬剤選抜による安定発現株の作成 削除/引用 No.10158-1 - 2022/01/07 (金) 12:17:43 - TS いつも勉強させていただいています。 クラシカルな手法で恐縮ですが、安定発現株の作成について教えてください。 動物細胞で、GFP融合タンパク質を発現する安定発現株を作っておりまして、リポフェクションでプラスミドを導入し、G418でセレクションしました。 その後、十分量の細胞数まで増やして、セルソーターでGFPポジティブの細胞を分取しました（モノクローンを取らないのが手抜きなのは承知です）。 質問はこのときのGFPポジティブの細胞割合についてです。 PlainのGFP、GFP融合タンパク質（目的）を発現させた細胞で、ポジティブの割合が高いものでも30％程度でした（ものによっては10％少しくらい）。 私の理解では、Neo耐性遺伝子だけがゲノムにインテグレートした細胞がGFPネガティブとして残ることはわかっているのですが、それでも薬剤選抜後のGFP陽性細胞というのはこのくらい少なくなるものかなと不思議に思っています。 Neo耐性遺伝子とGFP遺伝子の両方が入らいないと選抜できないわけなので、このくらいの割合が一般的でしょうか。 薬剤選抜はネガコンを使って十分に行っています（ネガコンは完全に死滅）。 どうぞよろしくお願いいたします。

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