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(無題) 削除/引用 No.10191-13 - 2022/01/26 (水) 23:25:42 - ふらいむ アルパカ由来の蛍光標識二次抗体がJackson、Thermo等から販売されてます。 他の種の重鎖抗体の1/10のサイズなので、浸透性は高かったはずです。 今後も汎用するなら、受託でVHHの1次抗体を作るのもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10191-12 - 2022/01/25 (火) 13:18:38 - ema 透明化・LightSheet観察になりますが、150 um　free flowting　14日ダイレクトコンジュケート抗体をしたことがあります。 ちなみに共焦点顕微鏡　とありますが、焦点深度が150 um-200 umは届かないと思うのですが、多光子もしくはLightSheet顕微鏡の観察でなくても良いのでしょうか。本当に透明化しなくて良いですか？

(無題) 削除/引用 No.10191-11 - 2022/01/23 (日) 22:38:50 - あの 目的とされることとは違うかも知れませんが、 ニューロンの軸索をうまく移動させられると 面白そう。

(無題) 削除/引用 No.10191-10 - 2022/01/23 (日) 22:35:56 - あの 詳細は知りませんが、ビブラトームって、 生きている組織に使うもので、固定して無いのでは？ あるいは、遺伝子導入で蛍光蛋白を作らせておいて、 厚切りして観察してるのではないかな。

(無題) 削除/引用 No.10191-9 - 2022/01/23 (日) 21:29:17 - 日々精進 クァswでrftgy不二子h樹んmjk様 ありがとうございます。 私自身、非常に難しいと思うのですが、150 - 200 umの脳の組織を染めている論文がありますので、可能なのだと思います。マテメソに書かれていないチップスがあるような気がしています。 神経細胞の走行をみるため表層だけでは不十分なので、どうにか厚めの組織を、と取り組んでいます。 ビブラトームで1 mmなどの組織を染めることもあるので、establishされた方法があるはずなのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.10191-8 - 2022/01/23 (日) 21:26:06 - 日々精進 PF様 ありがとうございます。 PF様の組織は生細胞組織だと読み取れましたが、そういうことも理由の一つとしてありそうですね。 私の場合はそれは難しそうです。 PF様のコメントを読み、今日、二次抗体を３時間行ってみましたが、結果は改善しませんでした。 50 で良くて、150ではだめなので、やはり厚さが染色の失敗の原因と思われます。 permeabilizationの工夫もいくつか試してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10191-7 - 2022/01/23 (日) 21:23:18 - 日々精進 あの様 コメントいただきまして、ありがとうございます。 神経細胞の走行をみたいため、通常50 umの脳組織を染めているのですが、50 umでは非常に綺麗に染まっています。 実は今日、150 umを染めたものをみたみたのですが、非常にムラがあり、バックグラウンドも高かったです。 ちょっと厳しそうです。 コラゲナーゼ処理はありませんが、ペプシン等で処理して軟骨を染めたことはありますが、脳で有効かは聞いたことはありませんね。ただ、参考になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10191-6 - 2022/01/23 (日) 18:21:57 - クァswでrftgy不二子h樹んmjk 前提としてかなり無理のあることを強引にやろうとしてるので、どこかで妥協しなくてはいけないのですが、抗体は分子量が大きいことがネックなので、Fab抗体でやればあるてど浸透効率は上がるのではないでしょうか。ていうか共焦点で見るなら、とりあえず見えればいいということなら、なるべく表面近くの断層面を見るようにすればいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.10191-5 - 2022/01/22 (土) 07:24:30 - PF 厚切り切片の染色経験はありませんが、1mm角に切ったヒト腫瘍組織培養を抗体治療薬で処理する仕事をしてます。37oCの標準的な培養24時間で、1mm角の組織全体に治療用抗体が浸透する事を確認してます。よって、一時間に1 umという事はないと思います。 抗体の浸透速度を気にするなら、２次抗体の1時間が短すぎるかもしれません。また、標的が細胞内タンパク質の場合は、permeabilisationの方法は工夫する余地があるように思います。

(無題) 削除/引用 No.10191-4 - 2022/01/22 (土) 01:54:11 - あの 分厚いですね。 透明化について以前得た情報でも、結局、奥深くまでどうやって 抗体を届けるかがネックになって、たしか電気をかけるような特殊な手法 が必要になるらしいです。 役に立つ情報かどうかわかりませんが、発現量の少ない膜タンパクのために 組織切片での免疫染色をしたいのに、どうしても細胞内側領域に対する抗体 しか無い状況があって、コラゲナーゼ等を色々使って解決をしようとしたことが あります。そのときも厚さは、10um程度での話です。

(無題) 削除/引用 No.10191-3 - 2022/01/21 (金) 18:56:21 - 日々精進 pupa様 ありがとうございます。 実は脳組織ですので、free flowting法は最適なものの一つと思います。 恥ずかしながら聞いたことはあったのですが、発想にありませんでした。 現在すでに切片を作製してしまっておりまして、どうにかこれらを無駄なく使用したいです。 ただぜひお示しの方法は今後試していきたいです。 pupa様は一晩、室温で抗体でどの程度まで深く浸透するかの数字をご存知でしょうか？ なかなか探しても見つからず、です・・。

(無題) 削除/引用 No.10191-2 - 2022/01/21 (金) 15:53:29 - pupa 組織にもよると思いますがフリーフローティング法はどうでしょうか？

厚めの凍結切片の抗体反応 削除/引用 No.10191-1 - 2022/01/21 (金) 01:36:13 - 日々精進 いつも勉強させてもらっています。 この度、組織の150 um-200 umの厚めの凍結切片を抗体染色し、共焦点顕微鏡で観察を計画しています。 これまで私は20-50 umを主に染めてきました。200 umは初めてです。 これまでのプロトコルと同様、1次抗体反応はオーバーナイト、室温で行い、2次抗体は１時間、室温で行いましたが、当然といえば当然ですが、染まりが悪かったです。 使用している界面活性剤は0.1% Triton X-100のみです。 厚めの切片の染色を改善する方法はありますでしょうか？ 透明化方法は抗原ダメージの可能性を考え、できれば避けたいところです。 また、おおよそ１時間あたり抗体はどれほど浸透しますでしょうか？ 確か１時間あたり10 umだったか1 umだったか、そのような書き込みを見た記憶がありますが、正確には覚えていません。 ご存知の方がいらっしゃいましたら、ご教示よろしくお願いいたします。

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