BioTechnicalフォーラム [TEVプロテアーゼでのGST-tagタンパク質の溶出]

TEVプロテアーゼでのGST-tagタンパク質の溶出

No.10202-TOPIC - 2022/01/25 (火) 19:55:53 - 精製初心者

日頃からお世話になっております。

この度GST-tagの付いたタンパク質を精製することになりまして、よくわからない部分がありましたので質問させていただきます。

GST融合タンパク質をglutathione sepharose 4Bでトラップし、溶出バッファーで溶出するのですが、一般的に使用されている還元型グルタチオンで溶出すると
溶出⇒TEVプロテアーゼでGST切断⇒４Bに再度通してGSTを除去⇒Ni-NTAに通してTEVプロテアーゼ除去
と工程が煩雑になってしまいます。
そこで還元型グルタチオンの代わりにTEVプロテアーゼで溶出し、
溶出⇒Ni-NTAでTEVプロテアーゼ除去
の方法を取りたいと考えております。TEVプロテアーゼでの溶出時間、温度などはそれぞれ条件検討をしていきたいと考えています（おそらく4℃o/nを採用）。

ここで質問なのですが、還元型グルタチオンで溶出する場合と同じように複数回に分けて溶出の工程を繰り返すと思うのですが、再度の溶出の際にもTEVプロテアーゼ入りのバッファーで反応させた方が良いでしょうか？TEVで長時間反応させたら十分GSTが切断されてPBSでも回収できるものでしょうか？

またそもそもこのようにTEVプロテアーゼで溶出しても良いものなのでしょうか？
もしよろしければご教授よろしくお願いいたします。
　

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ご教授ありがとうございます！

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No.10202-5 - 2022/01/27 (木) 13:00:16 - 精製初心者

みなさま、ご教授ありがとうございます。

TS様

GSHでも初回の溶出である程度落ちてくるものなのですね。his-tagタンパクの溶出とは少々違う点があり勉強になります。

precision proteaseでも同様なのですね。
タグ切断用のプロテアーゼ使用時の感触が分からなかったので、とても参考になりました。
ありがとうございます。

noname様

確かに効率については懸念事項ですね…条件検討次第といったところです。

ラボ内にあったものがhis-tag付きだったので、盲目的にプロトコルを考えていましたが、GST-tag付きも便利そうですね。
resinに捕まってしまう分、標的タンパクとの反応性が落ちてしまわないかが心配で４B resin中での溶出としての使用は難しそうですが、GSTでの溶出に切り替えてGST-tag付きTEVを使用する方法も検討していきたいと思います。
ありがとうございます。

中年様

完全にリサーチ不足でした･･･　一般的な方法なのですね。
安心してTEVでtag切断および溶出を行っていこうと思います。
ありがとうございます。

(無題)

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No.10202-4 - 2022/01/27 (木) 11:43:15 - 中年

TAP-tagの原報でもビーズ上でTEVプロテアーゼ消化をしていますので広く行われている手法だと思います。

(無題)

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No.10202-3 - 2022/01/27 (木) 11:23:22 - noname

レジンにくっつけたまま消化はできなくはないと思いますが、
かなり効率が落ちると思いますし、溶出の条件検討するほうが面倒な気がします。

シグマからGSTタグ付きのTEVが販売されているので、
それを使えば切ったGSTとTEVの回収が一発でできると思いますよ。
それか自分でGST-TEV fusion proteinを作るか。

(無題)

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No.10202-2 - 2022/01/27 (木) 08:23:33 - TS

レスがつかないようなので。TEVで切り出しはしたことなくて、わたしはPrescision protease、もしくはGHSで溶出（切り出しなし）のみなので、もし自分がやるとしたら的な感じですが。あとわかるところだけです。

>還元型グルタチオンで溶出する場合と同じように複数回に分けて溶出の工程を繰り返すと思うのですが、再度の溶出の際にもTEVプロテアーゼ入りのバッファーで反応させた方が良いでしょうか？

わたしはGSHで溶出するとき（GSTつけたまま回収して使う）も1回しかやらないです。もちろん回収率がやや低くなるでしょうが、たいがい十分量のタンパクが取れるので。もう少し増やしたいとかなら、培養液を増やせばいいかなと思う方です。

Precision proteaseを使うときは1回しかやらないです。ビーズの再洗浄も、回収率は少しは上がるんでしょうけど、それもマイナーな違いかなぁと。繰り返しやることを阻む意見ではないです。2回目以降にTEVを入れるかどうかは、1回目のTEVの量にもよるのかもしれませんが、あまり必要性は感じません。

>またそもそもこのようにTEVプロテアーゼで溶出しても良いものなのでしょうか？

溶出という言葉が少し引っ掛かりますが、TEVでタンパクを切り出したあとに、NiでTEVを除くという方法は、一般的と思います。やったことないです、どっちかと言えばこっちの方がよくやられるのではないでしょうか。

https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/tev-protease-apb.asp?entry_id=16493

TEVプロテアーゼでのGST-tagタンパク質の溶出

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No.10202-1 - 2022/01/25 (火) 19:55:53 - 精製初心者

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