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低分子量酵素の検出 トピック削除
No.1070-TOPIC - 2012/10/29 (月) 17:46:59 - US_KN
分子量1kDa未満の酵素を検出しようと考えているのですが、
ELISA法で検出するかWestern Blot法で検出するか悩んでいます。

今まで10kDa以上のタンパク質や酵素をWestern Blot法で検出していたのですが、
1kDa未満の酵素がWestern Blot法で検出可能であるのか疑問です。
勉強不足で大変恐縮ですが、
ご存じの方もしくは実際に低分子量の物質をWestern Blotで検出した経験がある方いらっしゃいましたら
アドバイス頂けると幸いに存じます。
宜しくお願い致します。
 
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(無題) 削除/引用
No.1070-15 - 2012/11/06 (火) 14:12:19 - US_KN
ー小言幸兵衛さん

参考論文を教えて頂きありがとうございます。
早速読んで勉強させて頂きます。

薬品はペプチドのものになります。
薬品と言いますか...栄養素ですね。
うまく説明できず申し訳ございません。

(無題) 削除/引用
No.1070-14 - 2012/10/31 (水) 23:16:46 - 薬品?
もう済みになってますが、気になったので…

> 1kDa未満の酵素というのは
> 体内に存在するものではなく
> 薬品をラットに投与して
> 臓器内での存在を確認したかったので
> 今回質問させて頂きました。
> 薬品が補酵素の働きをする物でして
> 低分子量の酵素ということで投稿致しました。
> 紛らわしい書き方をしてしまい、
> 大変申し訳ございません。

薬品ってペプチドなのでしょうか?
化合物ならウェスタンで見れないですよね。

(無題) 削除/引用
No.1070-13 - 2012/10/31 (水) 22:04:10 - 小言幸兵衛
アミロイドβ(40-42aa)をウエスタンできれいに検出しようとするときには、尿素の入ったゲルで泳動したりします。9aaに比べると大きいですが、参考になるかもしれません。

Biochemistry. 2006 Mar 28;45(12):3952-60.

本当にありがとうございます。 解決済み 削除/引用
No.1070-12 - 2012/10/31 (水) 18:06:24 - US_KN
みなさん本当にありがとうございます。
たくさんのアドバイスのおかげで、プレ実験の方向性が見えてきました。

1kDa未満の酵素というのは
体内に存在するものではなく
薬品をラットに投与して
臓器内での存在を確認したかったので
今回質問させて頂きました。
薬品が補酵素の働きをする物でして
低分子量の酵素ということで投稿致しました。
紛らわしい書き方をしてしまい、
大変申し訳ございません。

おおさんの論文や前処理のアドバイス大変参考になりました。
小言幸兵衛の指摘や
~さんのマーカに関するアドバイスもとても勉強になりました。
なんとかWestern Blot法で検出できるよう
頑張ってみたいと思います。
本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1070-11 - 2012/10/31 (水) 13:17:05 - おお
ひとつきになるのは通常のタンパクのためのライセーと(マンマルとかで)でやると、低分子側、場合によっては結構乱れる可能性があります。混入している脂質や核酸または使ったでタージェンととかの影響もある可能性があります。

なのでなにか前処理できた方がいいのかなぁという気がします。たとえばTCA何かで抽出してC18で吸着して一気に溶出させて試料をえるとか。んーんほかにもっといい方法があるかもしれませんけど。。。

(無題) 削除/引用
No.1070-10 - 2012/10/31 (水) 11:28:14 - ~
おおさんの挙げられた論文で使われていたマーカーに、
Glycine hexamer
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/G5630?lang=ja&region=JP

Tyrosine hexamer
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/T1780?lang=ja&region=JP
を足すといいのかもしれません。

ただ、目的の配列で合成したほうが安いし、アミノ酸配列による移動度の違いも起きないのでいいでしょうね。

合成するのであれば、まずはドットブロットでメンブレン上で抗原性が失われていないかを確認するところからでしょうか。
それで駄目なら、泳動条件を検討する必要がなくなるでしょうし。

(無題) 削除/引用
No.1070-9 - 2012/10/30 (火) 14:59:16 - Tukey
すみません、新しいトピックを作るつもりがここに書き込んでしまいました。
無視して下さい。

mRNA相対量の有意差検定について 削除/引用
No.1070-8 - 2012/10/30 (火) 14:52:21 - Tukey
刧僂t法を用いてmRNA発現量をみています。
今、下記に示しますような、A群からC群の3群のmRNAの相対量のデータがあります。各群n=6で、A群の相対量を1としています。

相対量  SE
A 1.000 ± 0.155
B 0.539 ± 0.057
C 2.650 ± 0.470

これをTukey法で有意差検定した場合、A群とC群、B群とC群は有意差ありになるのですが、A群とB群で有意差がありません (p=0.5位です) 。
グラフを作ってみると、A群とB群でも有意差がありそうに見え、参考にA群とB群でt検定をするとp<0.05となり有意差があります。

対照群の値に対して値が大きい群と小さい群がある場合で多重比較検定をすると、対照群と値の小さい群では有意差が出にくいということはあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1070-7 - 2012/10/30 (火) 13:17:59 - おお
あ、そこはあえてつっこまなかった。。。

酵素なんですか? 削除/引用
No.1070-6 - 2012/10/30 (火) 12:49:38 - 小言幸兵衛
1kDa未満の酵素なんてあり得るんですか?

9残基で安定に高次構造を取れるんだろうか?

(無題) 削除/引用
No.1070-5 - 2012/10/30 (火) 12:21:20 - おお
アミノ酸10こより短いですよね。委託合成して持っておけばポジコンになりますね。それでWBの検討をしてみればどうでしょうか。そう極端に短いと銀染色すら難しいかもしれませんけど。。。2ー30のペプチドでも検出にくろうしました。含まれているアミノ酸にも依存しますけど。
メンブレンはPVDFの0.2umポア(ペプチドシーケンス用)を使った方がいいでしょうね。

(無題) 削除/引用
No.1070-4 - 2012/10/30 (火) 11:51:10 - US_KN
ーおおさん

アドバイスありがとうございます!!
確かにマーカーの入手は困難かと思います。
分子量が低いことも問題ですが
組織内の存在量も極微量であるため
Western Blot法での検出が可能かどうか...

(無題) 削除/引用
No.1070-3 - 2012/10/29 (月) 22:33:08 - おお
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269711004039

(無題) 削除/引用
No.1070-2 - 2012/10/29 (月) 22:31:46 - おお
1kDaまでならTRISーTRICINで何とかなるかもしれないけど、、、
マーカーもないよね、、、マーカーになるものがみつけられれば条件は探れるかもしれないけど。

http://mic.sgmjournals.org/content/148/11/3347.full

低分子量酵素の検出 削除/引用
No.1070-1 - 2012/10/29 (月) 17:46:59 - US_KN
分子量1kDa未満の酵素を検出しようと考えているのですが、
ELISA法で検出するかWestern Blot法で検出するか悩んでいます。

今まで10kDa以上のタンパク質や酵素をWestern Blot法で検出していたのですが、
1kDa未満の酵素がWestern Blot法で検出可能であるのか疑問です。
勉強不足で大変恐縮ですが、
ご存じの方もしくは実際に低分子量の物質をWestern Blotで検出した経験がある方いらっしゃいましたら
アドバイス頂けると幸いに存じます。
宜しくお願い致します。

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