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(無題) 削除/引用 No.11438-7 - 2023/05/13 (土) 12:44:47 - おお ＞細胞外ドメインのみ（膜貫通ドメインなし）とFcを融合したものが売ってたりしますからそれかもしれませんね。 この前提でかいてました。実際にそのようなので良かったです。因みに生体内にはDetergentはないですからね。

(無題) 削除/引用 No.11438-6 - 2023/05/13 (土) 06:49:23 - ブルヒッター 皆様、レスをありがとうございます。 膜タンパクFc Chimeraは774Rさんの推察通りのもので、この膜タンパクと結合するligandの研究の為によく使われています。 おおさんの >ネガティブコントロール（あなたの場合IgG）で非特異が出てないなら問題ない >界面活性剤なしのそういった実験もちらほら見ます に勇気づけられて、取り敢えず現時点ではこれで論文にしようと思います。 将来的には、皆様仰る通りに別の方法で結合を試す必要とそれに伴う困難が出てきて、また質問させていただくことがあるかもしれません。その時はまたよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.11438-5 - 2023/05/12 (金) 21:55:30 - い 今の段階ではこれはこれでいいと思いますが、いづれどこかの段階で、細胞を使い内在性のもので結合性を検証することが必要になると思われます。そのさい、この蛋白質は膜蛋白質ということですので、IPの試料の調製の際に可溶化のために界面活性剤などを使用することが必要になるかもしれません。一方で、投稿にある精製蛋白質をつかった予備実験の結果から、もしこの蛋白質複合体の相互作用は界面活性剤存在下では維持できないということでしたら（そういう理解でよいでしょうか。あるいは界面活性剤ありの条件でもいけてのでしょうか。）、なにか対策を考えないといけないかなあとおもいました。 市販の精製蛋白質が界面活性剤なしでも普通に溶けてるのならば、膜蛋白質といっても表在性のものでしょうか。炭酸ナトリウム法とかでも可溶化できるような感じなら界面活性剤使わないですみますが。

(無題) 削除/引用 No.11438-4 - 2023/05/12 (金) 10:33:19 - 774R >Fc Chimeraは、膜タンパク質だけれど界面活性剤なしで溶解しているということなのですね？ 細胞外ドメインのみ（膜貫通ドメインなし）とFcを融合したものが売ってたりしますからそれかもしれませんね。 おっしゃるとおり、IPだけでなく複数の方法で確認することが大事ですね。

(無題) 削除/引用 No.11438-3 - 2023/05/12 (金) 09:00:04 - qq 膜タンパクFc Chimeraは、膜タンパク質だけれど界面活性剤なしで溶解しているということなのですね？ ちょっと、不納得です。一晩のうちに、Xと膜タンパクFc Chimeraが凝集したのも、特異的結合であると言えるのかと言う点が指摘されそうです。 Xの方のコントロールも用意できると良いかもしれません。 IPよりも細胞に発現させて蛍光抗体のような方法が、納得できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11438-2 - 2023/05/12 (金) 04:44:27 - おお ネガティブコントロール（あなたの場合IgG）で非特異が出てないなら問題ないです。 界面活性剤なしのそういった実験もちらほら見ます。

界面活性剤無しでの免疫沈降やプルダウンアッセイ 削除/引用 No.11438-1 - 2023/05/12 (金) 03:52:49 - ブルヒッター 新しく見つけたタンパクXが、既知の膜タンパクと結合するかどうかを調べています。 既知の膜タンパクはFc Chimeraのものが売っているので、これとXを4度で一晩反応させ、翌日にDynabeads Protein Gと10分反応させてから洗浄、溶出(pH2.2のElution Bufferを使った)を行いました。溶出したサンプルをゲルに流してタンパクXに対する抗体でウェスタンブロットを行い、バンドが出るならば結合すると解釈できるだろうと考えました。 ネガティブコントロールとして、Fc-Chimeraがヒトのものだったので、ヒトIgGを膜タンパク-Fc Chimeraの代わりに加えたものを準備しました。 何度か条件を変えながら試したところ、「界面活性剤無しのBufferでXと膜タンパクFc Chimeraを反応させた」場合にはバンドが出ることが判明しました。この時ネガティブコントロールではバンドは全く見られません。 ここで質問なのですが、免疫沈降やプルダウンアッセイで界面活性剤が使われるのは、非特異的な結合を防ぐ為だと思います。界面活性剤抜きでの私の実験ですが、Xと膜タンパクは特異的に結合すると言っても差し支えないでしょうか？ 自分の解釈としては、私の実験系ではきちんと結合が見られた、ヒトIgGのネガコンでは全くバンドも見られないしこれは特異的結合である、と主張して良い（というか論文にするときはそのままの条件を書く）と思っています。できなければ、何の為のネガコンなんだ？ということになりますし。 ただ、私はこの手の実験は経験に乏しく、もしかしたら「界面活性剤抜きでやるのはご法度だ」などがあるのに自分が知らないだけなんじゃないだろうな？と不安になって質問させて頂く次第です。よろしくお願いいたします。

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