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(無題) 削除/引用 No.11440-9 - 2023/05/13 (土) 00:51:50 - たろー お返事が遅くなりすみません。たくさんのご回答をいただきありがとうございます。大変参考になります。 質問の前提をあまり詳しく記載しておらず恐縮ですが、P2A後にシグナルペプチドをつければ膜タンパク質(膜貫通ドメインを保持しているもの)が膜に発現するという論文はいくつかあって、自身の手でもそちらは確認しております。今回はシグナルペプチド先頭のメチオニンが必要かどうかが気になって質問させていただいておりました。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269709008082 ご回答の中でメチオニン付近の数塩基はあまり大事ではないというご意見があり、少し安心しています。自分でも試すことにはなるのですが今回いろんな条件のコンストラクトを大量に作らねばならず、既知の不安要素は減らしておきたいと思い質問させていただきました次第でした。 ATGを削りたかった理由はいくつかあって、1) 使っているシグナルペプチドの配列的にATGが入るとNcoIサイトができてしまいクローニング時に少し困る、2) レトロウイルスベクターを使って3-4つの膜タンパク質を2Aでポリシストロニックに発現させたいので可能な限り不要な配列を削りたい、3) CDSの途中でkozak様配列とATGがあると第二の翻訳開始点として働き全体の翻訳効率を落としてしまうことが稀にあるのでそれを心配していた、ということがあります。あと単純に科学的な好奇心もありました。 また、よろしければ一点追加でお伺いしたいのですが、回答でもありましたようにシグナルペプチドは小胞体への輸送シグナルであり、形質膜への輸送か分泌かを決めるのは膜貫通ドメインなどの別のシグナルであると理解しているのですが、実際に使用されているケースをみると膜タンパク質の発現のためのシグナルペプチドは膜タンパク質由来のもの(CD3など)、分泌タンパク質の発現のためのシグナルペプチドは分泌タンパク質由来のもの(アルブミンやIL-2など)を使っているケースが多く見受けられます。膜タンパク質由来と分泌タンパク質由来のシグナルペプチドで、何か機能に違いはあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11440-8 - 2023/05/12 (金) 18:54:44 - あああ 例えば今流行りのCAR-Tは、CAR遺伝子の後ろにIL-15(やIL-15R)を連結させて発現させています。後ろのORFはメチオニンがついたままです。 メチオニン有る無しで比べたことはないですが、メチオニンを外したい理由はどうしてでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11440-7 - 2023/05/12 (金) 18:44:06 - Karas GFP-P2A-膜タンパク質 の配列で膜タンパク質5種類ほど発現を見たことがあります。 P2A後のメチオニンは入れていましたが、削除したものは検討したことがありません。

(無題) 削除/引用 No.11440-6 - 2023/05/12 (金) 18:01:15 - G25 よく考えたら、無理筋ではないですね。 リボゾームスキップによって一旦途切れてから、後続のシグナル配列が翻訳されたところでSRPがくっついてERにドッキングすればintringicの膜タンパク質と同じことですね。

(無題) 削除/引用 No.11440-5 - 2023/05/12 (金) 17:52:31 - 独り言 ２Aの後ろにシグナルペプチド入れたら、小胞体に行くんですよね。 PMID: 15260831 DOI: 10.1111/j.1398-9219.2004.00205.x シグナルペプチドは、細胞質で翻訳されてる最中にN末端がSRPに認識されてから小胞体に移行するので、２Aが切れた後にシグナルペプチドが認識されるのでしょう。 ２Aの後ろのシグナルペプチドのメチオニンはあってもなくても、どちらでも大丈夫でしょう。 経験的に、普通のシグナルペプチドのメチオニン付近を数塩基いじっても、影響ありません。

(無題) 削除/引用 No.11440-4 - 2023/05/12 (金) 17:25:55 - -- 詳しくなないですが、II型の膜貫通タンパクがあるのだから原理的に無理とは言い切れないのではないかと思いますがどうでしょう。 どのようなシグナル配列が使えるのかはわからないですけど。

(無題) 削除/引用 No.11440-3 - 2023/05/12 (金) 15:52:06 - G25 理屈から言って無理じゃないでしょうか。 N末端のシグナルペプチドは、rER上のリボソームで翻訳されながらER内腔に侵入し、シグナルペプチド領域が侵入しきったところで割断され、それに続くペプチドもまた翻訳と共役してER膜を横切っていくわけです。 シグナルペプチドが付いたままのプレペプチドが翻訳された後に、シグナルペプチドがERにターゲットするというわけじゃありません。 前P2AペプチドがN末シグナルペプチドを持たなければ後P2AペプチドもrERではなく細胞質で翻訳されER内腔には入っていかないはずですね。 ちなみにシグナルペプチドとして働くのにN末端のMetは必須ではないはず。 原核生物ではよく知られていますが、真核生物でも多くのタンパク質は翻訳開始直後にメチオニンアミノペプチダーゼによってMetが切り落とされています。

(無題) 削除/引用 No.11440-2 - 2023/05/12 (金) 15:36:17 - おお 面白い視点だけど、結構トリッキーなきがするのでそれをわざわざやるのは何か理由がある場合かもしれない。特に昔は、ペプチドが切断されると考えられていたのもあるし。 ん、てかTCR-β てまくタンパクですよね。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2567.2012.03574.x

P2A配列後のシグナルペプチドについて 削除/引用 No.11440-1 - 2023/05/12 (金) 12:56:18 - たろー お世話になっております。 現在P2Aリボソームスキップ配列の後に膜タンパク質を発現させるコンストラクトを作製しています。P2A後にシグナルペプチドが必要だということはわかるのですが、シグナルペプチドのファーストメチオニンが必要なのかふと気になって調べているのですが、中々それを示した論文が見つかりません。先頭のメチオニンはSRPの認識に必要な疎水性領域とは距離があり、理屈としては不要かと思うのですが、どなたかこちらを実験で証明した論文にについてご存知でしょうか？文献でなくても、過去に試したことがあるという経験談のようなものでも構いません。どうぞよろしくお願いいたします。

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