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(無題) 削除/引用 No.11441-10 - 2023/05/16 (火) 20:28:08 - あの 最近は、自分でゲルを膨潤させてカラムに載せるような作業は、すっかりしなくなりましたが、 やっていた頃には、先端を切り落としたチップをつけたピペットマンを使ってました。 1000ulとか5000ulあたりです。

(無題) 削除/引用 No.11441-9 - 2023/05/16 (火) 16:45:03 - SYBR master >[Re:1] akibooooさんは書きました : > 4gのSephadex G50を50mlのMQに溶解して、半日以上膨潤させたものを使っています。 膨潤したゲルは、ピペット等では取り使いが難しいので、マルチスクリーン用には、カラムローダー(Cat.No.MACL09645)というものがあります。容量が複数種ありますが、sephadex G50用は45 microLの物ですので間違えないでください。値段は少し高いですが安定した結果を出すには必要で、各ウェルに必要なsephadex量を粉のまま詰めることが出来ます。これをdDW 300 microLで30分以上(１時間以上が確実）膨潤し、dDWの受け皿に乗せて遠心して余分なDWを除いた後で使用します。 遠心速度ですが、sephadex G50の推奨速度および時間は、1000×g, 1minです。一般的な96 well plateのスイングローターは遠心半径が大体100 mmですが、このときに1000xgになるには大体3000 rpmです。しかし、マルチスクリーンをseqの精製用に使用するときは、sequencerがApplied Bioの物であれば下からplate holder, 96 well plate (たしかリム付きのハーフスカート), multiscreenの順で載せていると思いますが、大体1cm程度底上げされていますので、遠心半径を90 mmで計算しており、3150 rpmで回してました(思い出しました)。最近の遠心機はデジタル表示でかつ”rpm”と”xg”の表示を切り替えられるようになっていますが、当時のまだアナログだったので、この計算に基づいて回していました。 速度と半径の計算は、遠心機メーカーのトミーのHPに換算用シュミレーターがあったはずです。 > このプレートは高いので、使用後は水で洗って、DWですすいだ後に、3500rpmで5分間遠心して再利用しています。 膨潤ゲルをゴミ箱に捨て、DWですすいだ後、遠心しなくてもそのまま乾かせば(半日程度で乾く)使用出来ます。ゲルが残っているとカビが生えますので、そこだけ注意してください。

(無題) 削除/引用 No.11441-8 - 2023/05/15 (月) 18:15:40 - G25 >そもそもちゃんとベッドされていて平衡化（溶媒に膨潤しているというだけでなく、一定の遠心条件で一定の流量になるように物理的意味でも）していれば、アプライ体積と回収体積が大きく異るということはないはず。 ひょっとすると遠心力が強すぎて、前処理の遠心で膨潤水が抜けすぎてゲルが脱飽和してしまっているのかも。たぶんゲルろ過スピンカラムだと遠心条件は1000 xg, 2 minくらいが相場だと思うけど、あなたの使っている製品、遠心機の仕様を確認してみて。2000 rpmで5分間遠心というのはtoo muchのように思える。 プレパックの市販品を使う場合はさておき、1-mLディスポシリンジなんかに Sephadexを詰めて100%ハンドメイドのスピンカラムを作るときなんかは、 最初の遠心で膨潤バッファを抜いた後、サンプル体積と同量の空バッファーを同条件で遠心して流す操作を1, 2回繰り返してから、本ちゃんの遠心濾過をしたりする。空バッファを流す過程で平衡が安定し、また溶出体積が多すぎたり少なすぎたりする不具合を予めチェックできる。

(無題) 削除/引用 No.11441-6 - 2023/05/15 (月) 17:08:18 - G25 ゲルろ過で余計な画分が混入するのは、ゲルベッドの身割れやカラム壁との隙間にサンプル液が流れ込んだためというのがありがちですけど。 シングルのスピンカラムしかつかったことないけど、それだと、まず失敗することはありません。マルチウェルタイプのカラムを使いこなすのはかなりトリッキーなんじゃないでしょうか。ゲルベッドに問題がない、ちゃんとゲルベッドの真ん中にアプライできているか、十分に目が行き届かないと思うし。 そもそもちゃんとベッドされていて平衡化（溶媒に膨潤しているというだけでなく、一定の遠心条件で一定の流量になるように物理的意味でも）していれば、アプライ体積と回収体積が大きく異るということはないはず。

(無題) 削除/引用 No.11441-5 - 2023/05/13 (土) 21:51:05 - G25 ストレートな回答ではないけど、 多検体でスループットや操作の負担を軽減するなら、 やや高価だけどXTerminatorを使うのもコスパはいいかも。 プレート遠心機があるなら、プレートでEtOH沈殿するのもスループットはいい。 遠心力が低い遠心機でも時間を延長すればいける。 BigDyeのマニュアルにも選択肢の一つとして出ているはず。

(無題) 削除/引用 No.11441-4 - 2023/05/13 (土) 15:07:55 - SYBR master >[Re:1] akibooooさんは書きました : > シーケンスの結果は綺麗なのですが、 > 65-80bp > 100-115bp > 175-190bp > 付近に大きなピークが出てきてしまい、NNNNとなってしまいます。 > 175-190bpのピークは小さいですが、それでもNNNとなってしまいます。 > > このような現象はどうして起こるのでしょうか？ > どのようなことを気をつければよいのでしょうか？ > シーケンスプライマーを200bpくらい5’側に設計すれば良いのでしょうが、読める領域が狭まるのでやめたいです。 Sanger seqのトラブルシュートでは、"spike"と呼ばれるモノで、原因についてはよく解っていません。ゲル板の時は余り起きず、キャピラリーシークエンサーで起きることから、不純物や空気の泡等がカメラの前を通過し、その時散乱が起こって起きているのでは無いかと考えられています。３箇所も出るのは希だと思いますが、残念ですが再度読むしか手は無いです。 自分が行ったことのある精製プロトコルなので、気になったのは、マルチスクリーンにG50を詰めて、水を入れて膨潤した後の、遠心スピードが、遠心半径にもよるとは思いますが、2000 rpmではなかったような記憶があります(行っていたのは20年以上前で、すでに資料は手元に無く、不確かでゴメンナサイ）。ミリポアか旧GE(Sephadex G50)のプロトコル再確認して下さい。たしかプロトコルでは、"rpm"ではなく、"xg"で表記されていると思いますので計算してみて下さい。 またG50による精製産物は　ドライアップ(たしか80度30分、thermal cyclerで蓋空けて放置）後に、HiDi ホルムアミドで溶解して泳動にかけてました(溶かした後、溶解促進と２次構造の緩和のため、thermal cyclerで熱変性したような記憶もあるが、これも不確かです）。HiDi ホルムアミドで溶解したサンプルでは、spikeは起きた記憶は無いです。ドライアップしたプレートは、ホイルで遮光しておけば、４度で１週間ほど、-20度で１月ほど保存できます。試したことは無いですが、-20度なら１年近くは保存できると思います。 ミリポアのマルチスクリーンを洗って(蒸留水ですすぐ）再使用するのは、使い捨てにするには余りに値段が高すぎるので私が始めましたが、ミリポアさんから「(製品売れなくなるから）広めないでね」と言われたことがありますので、その点は問題にはならないです。

(無題) 削除/引用 No.11441-3 - 2023/05/13 (土) 12:48:01 - おお カラムの場合EDTAが入っていたほうがうまくいくとかあるだろうか。。。

(無題) 削除/引用 No.11441-2 - 2023/05/13 (土) 12:39:23 - おお Dyeが抜けてないですね。 昔同じようにG-50を使って配列をルーティーンで読んでいたラボにいましたがワークしてましたけどね。。。 G-50はスーパーファインでしょうか。 膨潤は数時間で終わるはずだし（念のため少し温めてもいいかもしれませんけど） あと考えられることは乗せる容量を半分ぐらいに減らす。乗せてからしばらく放置しておいて、拡散してDyeがG-50のポアの中にある程度入り込むのを待つ。 G-50に乗せるとき、溶液は中心あたりに乗っけてますかね。壁をつたうような感じだと、何となくだけどすり抜けていきそうな気がする。 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/cms_053270.pdf https://www.cytivalifesciences.com/en/us/support/products/sephadex-g-50-fine-500-g-17004202

BigDyeの除去　Sephadex G50で精製すると大きなシグナルが 削除/引用 No.11441-1 - 2023/05/13 (土) 10:36:05 - akiboooo サンガーシーケンスを行っております。 サンガー反応を行った後（PCR）に、BigDyeの除去をSephadex G50を使ってやっています。 4gのSephadex G50を50mlのMQに溶解して、半日以上膨潤させたものを使っています。 300µlのSephadex G50をカラムに詰めて、2000rpmで5分間遠心し、カラムを新しいチューブに移し、カラムにPCR産物をアプライして2000rpmで5分間遠心し、出てきた溶液をシーケンスしています。 シーケンスの結果は綺麗なのですが、 65-80bp 100-115bp 175-190bp 付近に大きなピークが出てきてしまい、NNNNとなってしまいます。 175-190bpのピークは小さいですが、それでもNNNとなってしまいます。 このような現象はどうして起こるのでしょうか？ どのようなことを気をつければよいのでしょうか？ シーケンスプライマーを200bpくらい5’側に設計すれば良いのでしょうが、読める領域が狭まるのでやめたいです。 追伸 プロトコールに書かなかったのですが、PCR産物をカラムにロードして遠心したときに、出てくる溶液の量が20ul未満であるときが時々あります。その時は適量のMQをカラムに載せて再度遠心して20ulくらいになるように調節しています。調節しないこともありますが、その時も大きなピークが出るのであまり関係ないかと思っています。 ちなみにBigDyeはPCR10µlの系に0.4µl使っています。 エタチンしてHiDiに溶かすときには、このような大きなピークはでません。 シーケンスを今後4000サンプルくらいする予定ですので、ゲル濾過（Sephadex G50）を使う系を避けて通ることができません。 カラムは96穴のプレートタイプのものを使っています。Millipore社のマルチスクリーンというものです。 このプレートは高いので、使用後は水で洗って、DWですすいだ後に、3500rpmで5分間遠心して再利用しています。 よろしくお願いいたします。

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