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(無題) 削除/引用 No.11448-7 - 2023/05/18 (木) 03:46:48 - おお LoxPは３０ｂｐｓ強の真ん中８塩基を挟んだパリンドローム配列になってますよね。 とりあえず私ならその３０ｂｐｓ強のセンス、アンチセンスで両末端がコヘッシブ（片方をCC突出もう一方をGG突出とか）でリン酸化されたものを合成で注文してアニーリングさせて、それをLigationで重合すれば数個つなぐのはそんなに難しくはないとおもう。 しかしながら配列がパリンドロームになっていることからアニーリングが難しいかもしれません。T7 Endonucleaseみたいなのでセルフでアニーリングしたステムループ状のものを除くとかしたほうがいいかもしれませんがそれが妥当な方法かわかりません。 ほかの方法は P-3'GCGCGGCACCATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT に対して５’がわのパリンドロームにアニーリングするP-3'CGTGATAACTTCGTATAあるいは、P-3'ATAACTTCGTATA-ATGTATGCを用意しておいてアニーリングしてポリメラーゼで伸長すればLoxPのセンス鎖とアンチセンス鎖をアニーリングするよりやりやすいかもしれない。上記の末端はBanI制限酵素処理で向きを一定にしてLigationできるようになっている（はず）。ただし一度Ligationされると切れない。切れる設計にもできるけど、ちゃんと設計できているかも含め一度自身でかくにんしてください。BanIのサイトは末端でどれだけ切れやすいかわかりませんが、もう少し伸ばしてもいいかもしれません。以下の論文では９ベースぐらい余分につけています。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202305001787?via%3Dihub 制限酵素はBanIでなくてもいいですが、実績のある酵素なのでそれで設計してみました。また上記の論文はBanIで切ったフラグメント（おそらく数十ベースの長さ）をLigationして１ｋｂｐ程度の長さのコンカテマーをつくりプラスミドに入れていると思います。それを考えると４、５個つなげて１２０ｂｐぐらいの長さは楽勝のようにも思えます。

(無題) 削除/引用 No.11448-6 - 2023/05/18 (木) 00:24:33 - プラスミどん 皆様 いろいろとご意見をいただきありがとうございます。 やはり手を出しやすいところとしては774さんの ＞このオリゴをアニールさせてポリメラーゼで１回伸ばす。制限酵素処理した後はカラム精製かフェノクロ・エタ沈で十分でしょう。切り出しは必要ないと思います。 切り出すとしても、120bpあれば大丈夫です。 だと思いますので、まずはその方針でやってみたいと思います。 AAさんの仰るように、二本鎖断片合成サービスも魅力的ではありますが、私自身繰り返し配列が心配だったり（仰るようにDIO/FLEXのような配列ではあります）いくらかは費用もかかるので、こちらは次の手として考えたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11448-5 - 2023/05/17 (水) 18:37:34 - AA loxのプライマーってその構造の性質上、変なふうにアニーリングしちゃうので結構難しいですよね。 loxP/2272両方ということはいわゆるDIO/FLEXのような構造でしょうか。 それぞれのloxの間にユニークな配列を入れてその部分でアニールするようなオリゴを合成すれば、ダイマーにしてPCR酵素で増幅できそうです。 長いオリゴは塩基単価も上がるし納期もかかるので50merくらいのやつで、制限酵素配列を付加するときのようにPCRでチマチマ増やしていくのが安価で早いのではと思います。 不慣れな場合は二本鎖断片合成サービスに依頼してしまうほうが結果的に低コストになることも多いです。500bp未満だと多分1万円ちょっとです。 ただし、繰り返し配列があると断られることも多いです。DIOくらいなら大丈夫かなという気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.11448-4 - 2023/05/17 (水) 18:25:07 - 774 >オリゴDNA合成で対応できるギリギリの80bpのものをフォワード・リバースで作製しPCRするのは一つの方法かとは思いましたが、似た様な配列が続き、またPCR産物も短いため、うまく切り出しできるかなど不安があります。 このオリゴをアニールさせてポリメラーゼで１回伸ばす。制限酵素処理した後はカラム精製かフェノクロ・エタ沈で十分でしょう。切り出しは必要ないと思います。 切り出すとしても、120bpあれば大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.11448-3 - 2023/05/17 (水) 17:15:31 - G25 タンデムリピート配列だと、ずれてアニールした二重鎖もできるので言うほど簡単じゃなさそう。

(無題) 削除/引用 No.11448-2 - 2023/05/17 (水) 14:37:02 - ossi 自分なら、アニールしたオリゴDNAを約60bpずつ2ペア準備して、制限酵素処理したベクターに3 piece ligationします。

似た配列を繰り返す遺伝子の合成 削除/引用 No.11448-1 - 2023/05/17 (水) 12:10:34 - プラスミどん loxPとそのバリアント（lox2272の様な）をタンデムに並べた120bpほどの配列を作製したいと思っています。 オリゴDNA合成で対応できるギリギリの80bpのものをフォワード・リバースで作製しPCRするのは一つの方法かとは思いましたが、似た様な配列が続き、またPCR産物も短いため、うまく切り出しできるかなど不安があります。 遺伝子合成の方がよいのでしょうか？ 他、良い方法がありましたらお教えいただけましたら幸いです。 出来た産物は手持ちのプラスミドに挿入するのに使います。 よろしくお願いいたします。

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