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(無題) 削除/引用 No.11522-3 - 2023/06/30 (金) 11:10:21 - AAV >Karas様 コメントありがとうございます。ウイルス導入が困難な細胞を対象としていることとどうしてもベクターとしてAAVを使いたい事情があり、セロタイプ検討は主要なものについて済ませたうえで目標とする AAV titer を算出したのですが、なかなか妙案はないのかもしれませんね。私はカラム精製のみしか経験がなく超遠心法を試したことがないので、一度試してみようかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.11522-2 - 2023/06/23 (金) 13:14:44 - Karas そちらのキットを使ったことがなかったので、1e13 vg/mLまでいけることに驚きました。その値以上のAAVを得る実験では、いつもT225フラスコ10本からはじまり超遠心やらで200uL程度にまで濃縮精製しております。 そのため、現在のプロトコールの何を変更したらタイターが上がるのかについて有意義なコメントは難しいですが、ただ1点その濃度でないと遺伝子が入らないというのは相当な事態に思われます。 もしかしたら既に検討済かもしれませんが、カプシドの種類を変更したり、AAVに拘らないのであれば他のベクターに変更するというのも手かもしれません。

高タイターのAAV調製 削除/引用 No.11522-1 - 2023/06/15 (木) 04:22:20 - AAV in vitro、in vivo で高いタイターのAAV調製が必要で、良い方法がないか探しています。トランスダクション効率の低い細胞を対象としているため、目標としては 5e10^13 vg/mL 以上の濃度で調製したいニーズがあります。 現在は下記の資材を使って発現精製しており、濃度は1e10^13vg/mLいけばいいほうです（150-200 uL くらいの容量に濃縮した値）。 細胞：AAVpro293T 増殖培地:10％非働化FBS入りDMEM 維持培地：:2％非働化FBS入りDMEM 発現プラスミド：pRC、pHelper、pAAV-GOI トランスフェクション試薬：TransIT293 ﾃﾞｨｯｼｭ：15-cm 10-15 枚/construct 精製：TaKaRa AAVproMaxi kit によるカラム精製 70%コンフルの細胞に上記を用いて遺伝子導入(20 ug/plasmid)し、翌日に2%FBS入り培地に交換後、2日間維持した細胞からAAVを精製しています。 枚数を増やしてカラムに乗せるサンプルを増やす、など試してみましたがなかなかタイターをあげられない状況です。ラボスケールでAAVを高い濃度で作れている先生いらっしゃいましたらぜひ情報提供いただけたら幸いです。

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