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(無題) 削除/引用 No.11560-17 - 2023/06/28 (水) 21:41:04 - S みなさま、回答ありがとうございます。 > 言わずもながのことと思っていらっしゃるかもしれませんが、 どういう設計のコロニーPCRでチェックしているのか（プライマーの設定）、なにをポジティブコントロールとしているのか、念のためspecifyしてくださいますか、 どう言う意味でしょうか？ 勉強不足でよくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.11560-16 - 2023/06/28 (水) 13:37:30 - G25 >コロニーPCRによるインサートチェックを行いましたが、いずれも挿入が確認できませんでした。ポジコンではインサートの増幅が見られました。 言わずもながのことと思っていらっしゃるかもしれませんが、 どういう設計のコロニーPCRでチェックしているのか（プライマーの設定）、なにをポジティブコントロールとしているのか、 念のためspecifyしてくださいますか、

(無題) 削除/引用 No.11560-15 - 2023/06/28 (水) 11:11:23 - Skeptics > > 特定のプライマー、特定の条件のみでPCRが上手く行かない理由なんて山ほどありますよ。 > > 初めから承知しております。 「PCR条件が不適切でインサートが増幅しなかった可能性は少ないと現時点では考えております。」 「コロニーの拾いすぎの可能性は低いと考えております。」 と繰り返しお書きになっているので、PCRのエラーのことはお考えになりたくないのかと誤解しておりました。

(無題) 削除/引用 No.11560-14 - 2023/06/28 (水) 09:58:59 - S みなさま、回答ありがとうございます。 > 特定のプライマー、特定の条件のみでPCRが上手く行かない理由なんて山ほどありますよ。 初めから承知しております。

(無題) 削除/引用 No.11560-13 - 2023/06/28 (水) 08:27:33 - おお >[Re:12] Skepticsさんは書きました : > うーん、何人かの方が指摘されていますが、まずは出てきたコロニーを数クローンミニプレップして本当に外なのかを確認してはどうですか？ > > 特定のプライマー、特定の条件のみでPCRが上手く行かない理由なんて山ほどありますよ。 全く持ってその通りです。最初のほうに書いたんだが、、、

(無題) 削除/引用 No.11560-12 - 2023/06/28 (水) 07:34:29 - Skeptics うーん、何人かの方が指摘されていますが、まずは出てきたコロニーを数クローンミニプレップして本当に外なのかを確認してはどうですか？ 特定のプライマー、特定の条件のみでPCRが上手く行かない理由なんて山ほどありますよ。

(無題) 削除/引用 No.11560-11 - 2023/06/28 (水) 04:51:39 - おお >[Re:6] Sさんは書きました : > おお様、asan様、回答ありがとうございます。 > > > PCRの副産物とかが邪魔している可能性がないかなと思ったのですが、精製方法は何でしょうか。 > > スピンカラム精製です。PCR後のアガロースゲル電気泳動の結果、単一のバンドが見られていたので、特にゲル切り出しは行いませんでした。 わたしはそれでもゲル切り出し推奨派です。見えない＝ないではありませんし、短ければ短いほど検出感度もわるくなり、たまたま入りそうな副産物ができていればその配列が入る効率が飛躍的にあがり、目的のものが入ったものを見つけるのが困難になりますから。 あとPCRの条件も見た目特異的見えても、それより厳しくして増えなくなる条件よりちょっと緩いくらいにして、サイクル数も抑えめにしたほうがよりいい結果に結びつくことが多いと思ってます。 > > > > ５０個ぐらいコロニーが出たという事ですが、 > "ポジコンもどき"、、、PCR条件が不適切でインサートが増幅しなかった可能性は少ないと現時点では考えております。 PCRに対してはそうかと思われますが、プラスミド（インタクト）を形質転換して５０個のコロニーですか？あれ、実際のコンストラクションのコロニー数でしたっけ。とにかくどれくらいの量形質転換したのでしょうか？コンストラクショングレイドのコンピの形質転換効率であれば１ｎｇでも少なくとも１０００個は出る計算になりますが。コロニーPCRのポジコンという意味では成り立っていると思います。 > > > > コロニーPCRのプライマーの設定はどうしていますか？ > > インサートのPCR増幅増幅時に使用したプライマーを使用しています。 これについての懸念はあなたはインサートのPCRプロダクトをシームレスの反応溶液に混ぜてプレート上に塗りたくっていますから大腸菌に入ってなくともインサートのフラグメントが存在しているという事です。まあ懸念という事でいつもうまくいかないという意味ではないですが、コロニーPCRでポジであっても実際にプラスミドを調製したら、、、、ってなことが起こっているというのを何度か聞いたことがあります。 > なので、コロニーPCRして正常に増えたとするとインサート長のものになります。一度、インサート側のフォワードとベクター側のリバースでコロニーPCRをして、プラスミド全長を確認するべきでしょうか。 全長を確認したとしてもコロニーPCRで確実にわかるのはそのPCRでかかる範囲が存在することだけでその残りの配列はプラスミドを調製して適切な制限酵素できるなりしないと目的のプラスミドになっているかは結論でません。今回は１ｋｂｐ以上で、ちゃんとかかっているようですが、ころにーPCRは結構雑な方法で精製したDNAを鋳型にPCRするよりはかかりにくくなるファクターがいろいろあります。なのでなるべく短くするほうが検出しやすくなります。インサートが塗りたくられているという懸念を考えると、インサートの内部とベクター側で３００ｂｐかそれ以下のアンプリコンでコロニーPCRしたほうがいいかなというのが私のある意味理想です。 インサートが入ってないコロニーの原因はインサートのテンプレートから来たOri、薬剤耐性マーカーを含んだ部分だったのかもしれませんね。DpnIで消化しているとは思いますが、それでも完全消化でないフラグメントがあれば起こりうると思いますので。

(無題) 削除/引用 No.11560-10 - 2023/06/28 (水) 00:38:40 - S 一部文字化けしていました。 文脈けら何となく分かると思いますが、50〜100%は、50から100個です。

(無題) 削除/引用 No.11560-9 - 2023/06/27 (火) 22:52:05 - S URさん、回答ありがとうございます。 コロニーの拾いすぎの可能性は低いと考えております。 同じタイミングで同方法により、他5つのクローニングも行っています(遺伝子全長および一部ドメインの除去といった形)。そちらもバックではコロニーが1、2個程度で、目的のプレートでは50〜100個のコロニーが生えてきました。そこで4個程度コロニーPCRをした所、50〜100%の確率で当たっていました。問題のクローニングプレートの形質転換体は合計10個程度コロニーPCRしましたが、全く当たりがなかったので、操作誤差があったとしても全てでコロニーを拾いすぎている可能性は低いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11560-8 - 2023/06/27 (火) 22:23:30 - UR コロニーを拾いすぎてPCRを阻害してるのでは？ そもそもバックグランドがそんなに低くて、50個もコロニーが生えてるのであれば、コロPなどせず３つ４つコロニーを拾ってミニプレしてシーケンスにかければ大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.11560-7 - 2023/06/27 (火) 15:30:30 - S ちなみにお聞きしたいのですが、推奨されているベクターとインサートのモル比からずれている場合は、バックグラウンドはないけど、いざコロニーPCRをしたら当たりがないと言ったが起こりうるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11560-6 - 2023/06/27 (火) 15:18:56 - S おお様、asan様、回答ありがとうございます。 > PCRの副産物とかが邪魔している可能性がないかなと思ったのですが、精製方法は何でしょうか。 スピンカラム精製です。PCR後のアガロースゲル電気泳動の結果、単一のバンドが見られていたので、特にゲル切り出しは行いませんでした。 > ５０個ぐらいコロニーが出たという事ですが、ポジコンではどの程度コロニーができましたか？ 私の説明不足で申し訳ございませんが、正確には"ポジコンもどき"のようなもので、コロニーPCRの際にサンプル画分では形質転換体コロニーを鋳型に取っているのに対して、"ポジコンもどき"では元々対象遺伝子がクローニングしてあったプラスミドを鋳型として取っておりました。そのため、PCR条件が不適切でインサートが増幅しなかった可能性は少ないと現時点では考えております。 > コロニーPCRのプライマーの設定はどうしていますか？ インサートのPCR増幅増幅時に使用したプライマーを使用しています。なので、コロニーPCRして正常に増えたとするとインサート長のものになります。一度、インサート側のフォワードとベクター側のリバースでコロニーPCRをして、プラスミド全長を確認するべきでしょうか。プラスミドが5000 bp後半台でインサートが1300 bp程度なので、並べて泳動すれば差が見えなくもない気はします。ただし、その場合、ポジコンもどきは取ることができませんが。

(無題) 削除/引用 No.11560-5 - 2023/06/27 (火) 10:05:25 - asan 1コロニーPCRによる検出エラー 2鋳型plasmid vectorなどの持ち込みによるバックグラウンドノイズ 3PCRプロダクトの副産物との不特定の組み替え 4microhomologyなどによる非特異的な組み替え とか色々あるので一般論で全ての場合をきめつけるのは無理です。

(無題) 削除/引用 No.11560-4 - 2023/06/27 (火) 01:50:13 - おお PCRの副産物とかが邪魔している可能性がないかなと思ったのですが、精製方法は何でしょうか。 あと５０個ぐらいコロニーが出たという事ですが、ポジコンではどの程度コロニーができましたか？ コロニーPCRのプライマーの設定はどうしていますか？片方がベクター、もう一方がインサートでないなら判断しにくいこともあります。かりに片方がベクター、もう一方がインサートの場合でもその組み合わせて、その配列ではPCRがかからないという事も否定出来ませんので（１００ｂぐらいのアンプリコンならほぼ（絶対とは言わない）大丈夫かもしれませんが）、場合によってはミニプレップして制限酵素で切って確認したほうがいい場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.11560-3 - 2023/06/27 (火) 01:29:09 - S はい。PCR産物です。

(無題) 削除/引用 No.11560-2 - 2023/06/27 (火) 01:23:14 - おお インサートはPCR産物ですか？

シームレスクローニング後のコロニーPCR 削除/引用 No.11560-1 - 2023/06/26 (月) 23:13:39 - S In FusionやNEBuilderのキットを用いてシームレスクローニングに取り組んでいます。 形質転換の際にネガコンとして、直鎖ベクターのみ、インサートのみのサンプルも同時に形質転換していますが、これらのプレートにはコロニーが1、2個程度であり、直鎖ベクター+インサートのプレートでは50個程度のコロニーが生えてきました。 そこで、コロニーを7個程度選抜して、コロニーPCRによるインサートチェックを行いましたが、いずれも挿入が確認できませんでした。ポジコンではインサートの増幅が見られました。 このような場合、考えられる原因は何かありますか？ ご教授いただけますと幸いです。

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