BioTechnicalフォーラム [メダカ脳の冷凍保存]

メダカ脳の冷凍保存

No.11569-TOPIC - 2023/06/29 (木) 16:09:17 - R

メダカの脳から発現解析用のRNAを取りたいのですが、
諸事情により液体窒素が手に入りません

①取ってすぐ-80℃冷凍庫に入れる
②取ってすぐ-20℃冷凍庫に入れる
③RNA抽出用試薬中でホモジナイズしてから-80℃に入れる
④RNA抽出用試薬中でホモジナイズしてから-20℃に入れる

どこまでならセーフでしょうか？

②は、アウトかとは思うのですが脳を取れる設備の近くにー80℃が無いので聞いてみました
②でも大丈夫な方法等あれば知りたいです。

③④はおそらく大丈夫なのですが一応の記載です。
　

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No.11569-6 - 2023/06/30 (金) 08:36:49 - ---

> ちなみに① 取ってすぐ-80℃でもあまり良くないものなのでしょうか？

私は劇的な影響を感じたことはありませんでした。BioanalyzerのRIN値に明確な差が出るほどの影響、という程度の意味ですので、全く影響がないとは断言できません。RNAlaterもしくは自作RNAlaterもどきでも、浸透が悪くてRNAが壊れたかもしれない、と感じたことはありません（RNaseが多いと言われる臓器でも）。ただ、色々状況の違いもあるでしょうから保証はできません。

お示しの中では(4)が一番良いとは思いますが。

(無題)

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No.11569-5 - 2023/06/29 (木) 23:44:06 - R

皆さんありがとうございます

ちなみに① 取ってすぐ-80℃でもあまり良くないものなのでしょうか？
(気相だと冷えないかもという意見はありましたが、念のため意見募集です

(無題)

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No.11569-4 - 2023/06/29 (木) 17:20:23 - あの

ある哺乳動物の脳を急遽　採取することになったときは、
自作のRNAlaterを急いで作ってサンプル採取したことがあります。
RNAseqに問題なく使えました、

メダカの脳なので十分小さいと思いますが、有効成分の硫安の浸透が遅れないように、
膜などを取れるだけ取った方が良いです。

(無題)

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No.11569-3 - 2023/06/29 (木) 16:52:21 - G25

3, 4がベストでしょう（だたしグアニジンなど強力な変性剤が入っている試薬中で）。その状態ならあわててフリーズしないでも、室温で落ち着いてハンドリングできます。

凍結するなら液体窒素で瞬間凍結。冷媒なしに冷凍室にポイとおいただけでは（チューブに入れるにしてもアルミホイルで包むにしても、入れ物や一緒閉じ込められた空気が断熱効果をもつし）、十分に早く凍結する保証はない。

RNAlaterも浸透速度は早くないので過信は禁物。whole brainくらいの大きさがあり油っぽい器官だと場合によっては危険かも。かといって更に小片に切り分けるなんてのも処理時間やダメージを増すことになるので避けたい。

(無題)

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No.11569-2 - 2023/06/29 (木) 16:17:21 - のなめ

下記のような保存試薬の利用はどうでしょうか。
試薬が組織に染みこんでくれれば効果は期待できると思います。

RNAlater：Thermo
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/brands/product-brand/rnalater.html

Gene keeper：Nippongene
https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/gene-keeper/gene-keeper.html

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No.11569-1 - 2023/06/29 (木) 16:09:17 - R

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