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(無題) 削除/引用 No.11873-5 - 2023/10/26 (木) 01:59:16 - おお >[Re:4] KHさんは書きました : > > おお様 > > ＞室温から５０度ぐらいでサンプルバッファーしょりをしてみてもいいかもしれません。 > エピトープによってはボイルでマスクされている可能性もあるということかと思いますが、それだと抗体Cはライセートでも検出できないのではないでしょうか？ > ライセートの変性と、IPした後の変性のされ方が異なるということでしょうか？ そうですね漠然とですが環境が変われば違うことが起こるかもと。いろいろなタンパクが周りにあるときはそのタンパク同士のあぐりげーとが起きにくいけど、IPで濃縮されたっ時は近接にそのタンパクがあってすぐアグルとか、妄想の域を超えないのですけどね。 通常あぐったときは高分子量にバンドがシフトします。これも妄想ですがバンドが高分子に分散されて検出しずらくなっているとか、非常に大きいあぐりげーしょんで分離ゲルに入れなかったりとか。。。えぴとーぷが隠れるケースが具体的に示されたものを見たことはありませんが、可能性の一つかもしれません。サンプルバッファー処理を低温でやるか、処理後飽和尿素水を同量かサンプルの半分量加えてあぐりげーしょんを解消して流すかすればその辺の可能性をみる（否定、および肯定）できると思います。 > > ＞抗体B作成時の抗原部位と抗体Cの抗原部位はオーバーラップしていますでしょうか。 > 抗体Cは明確な抗原部位が開示されていませんが、C末端のペプチド、抗体Bは全長のリコンビナントを抗原としています。 > それでは 抗体Cで認識できない分子種を特異的にIPしている可能性は低いですね、、、

(無題) 削除/引用 No.11873-4 - 2023/10/25 (水) 16:11:52 - KH hじおp様 ＞書かれているようなことは普通にあります ありがとうございます。 けっこう普通にあることなのですか？ 差し支えなければ、どのような理由でこうなるのか可能性をご教示いただけませんでしょうか？ おお様 コメントありがとうございます。 ＞検出しているバンドそれぞれがノンスぺである可能性を否定できればいいのですが。。。 おっしゃるとおりです。抗体Aで検出しているものはKOマウスやKD実験で標的タンパク質であることを確認しています。 抗体Cについても、KOマウスはもう使えない事情があるのですが、遺伝子発現が誘導される条件もありますので、その辺りはきちんと確認していきます。 （確認してから投稿せよと言われればその通りです。すみません。） ＞抗体CでIPできるなら、それを抗体Aで検出できるでしょうか？ データシートにはIP可能の記載ありませんが、一度試してみます。ありがとうございます。 ＞抗体BとCはラビットなので、IgGが検出されると思いますが、そのシグナルが強すぎて、シグナルを検出できる露光時間ではシグナルがかぶってしまっている可能性もあるのかもしれません。 はい、確かにIgGは見えていますが、標的（12kD）がIgGとはかなり離れていてそれで見えにくくなっていることはないと思います。 ＞室温から５０度ぐらいでサンプルバッファーしょりをしてみてもいいかもしれません。 エピトープによってはボイルでマスクされている可能性もあるということかと思いますが、それだと抗体Cはライセートでも検出できないのではないでしょうか？ ライセートの変性と、IPした後の変性のされ方が異なるということでしょうか？ ＞抗体B作成時の抗原部位と抗体Cの抗原部位はオーバーラップしていますでしょうか。 抗体Cは明確な抗原部位が開示されていませんが、C末端のペプチド、抗体Bは全長のリコンビナントを抗原としています。

(無題) 削除/引用 No.11873-3 - 2023/10/25 (水) 01:58:27 - おお 検出しているバンドそれぞれがノンスぺである可能性を否定できればいいのですが。。。 抗体CでIPできるなら、それを抗体Aで検出できるでしょうか？ 抗体BとCはラビットなので、IgGが検出されると思いますが、そのシグナルが強すぎて、シグナルを検出できる露光時間ではシグナルがかぶってしまっている可能性もあるのかもしれません。 エピトープに関してはSDSで変性させたからと言って消えることは普通ないと思います（３次構造を認識するような場合など以外）。ただボイルで変性してあぐりげーしょんを起こしやすいタンパクはありますので（質問のケースでは一部あぐって検出しにくくなっているとか）、室温から５０度ぐらいでサンプルバッファーしょりをしてみてもいいかもしれません。 また、IPが選択的で抗体Cのエピトープ部位が修飾されたものだけ沈降してくるなら、抗体Cでは検出できないという理屈はありますが、抗体Bはポリクロですしその可能性は低そうです。抗体B作成時の抗原部位と抗体Cの抗原部位はオーバーラップしていますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11873-2 - 2023/10/24 (火) 21:53:18 - hじおp 書かれているようなことは普通にあります

IP-western 削除/引用 No.11873-1 - 2023/10/24 (火) 16:51:40 - KH いつもお世話になっております。 皆さまのお知恵をお借りしたいと思い投稿します。 （もし過去のトピックで同じ議論がされていましたら重複ご容赦ください） vivoのサンプルであるタンパク質Xの検出をしようとvivoのライセートを使って抗体Aでウェスタンを試みていましたが、組織中の発現量が少ないのか、全く検出できませんでした。 そこでIPができる抗体Bを用いてIPで濃縮した後抗体Aでウェスタンをすると検出できるようになりました。 長くこのIP-westernで組織中のタンパク質Xを検出していたのですが、IPに使う抗体Bが残り少なくなってきたところで、市販の抗体で検出できるものがあるかもと思い抗体Cを購入し、やってみると、今度はライセートではきれいに検出できたのですが、IP後のサンプルでは検出されませんでした。 まとめると 抗体A：マウスモノクロ抗体　 ライセート−×、IP−〇 （抗体Aは培養細胞のライセート、強制発現のタンパク質は検出できます） 抗体B：ラビットポリクロ抗体（IPしかできない） 抗体C：ラビットモノクロ抗体 ライセート−〇、IP−× 抗体A, Bは外注で作製、Cは市販抗体 このような経験ございますでしょうか？ エピトープの問題と言ってしまえばそれまでなのですが、SDS含有で95℃でボイルまでしているサンプルでこのようなことが起こるものなのか？ 皆さまのご経験伺えれば幸いです。 宜しくお願い致します。

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