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(無題) 削除/引用 No.12471-11 - 2024/08/06 (火) 05:47:01 - E ELISAですがThermoFisherの37528を使って問題なくシグナルがでました。サンプルをもらえて試せるといいですね。

(無題) 削除/引用 No.12471-10 - 2024/07/31 (水) 20:36:07 - G25 NHSなんかでin vitro labelingするようなやつならあります。 https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/product/sigma/55865 でも質問者さんのやろうとしているのがEMARSやらAPEXのようなものだったら?あるのかしらん。 BirA*の系ならビオチン以外選択肢しないし。

(無題) 削除/引用 No.12471-9 - 2024/07/31 (水) 19:33:07 - あの Jさん ビオチン標識ではないもので標識という案には賛同します。その場合、Fitcで標識するキットとかなら入手できます。 横からで教えてほしいのですが、タンパクをdig標識するキットって市販品ありましたっけ？ dig標識は、もっぱら核酸の標識に用いるものと思いこんでました。

(無題) 削除/引用 No.12471-8 - 2024/07/31 (水) 11:20:32 - J ビオチン化は生理的な翻訳後修飾の一つなのでcontrolでも多数のシグナルが見えるのは内在性ビオチン化タンパク質（例：ピルビン酸デカルボキシラーゼとか結構いろいろある）と反応してる結果と思うので、non-specificとかblckingの問題ではなくて、それある意味で正しい結果でもあります。 この問題は以前からいろいろ対策を考えてる人はいるようですので、一度論文などをチェックしてみてください。ていうかABC法にこだわることもないと思うので、内在性のものがないDIGなど別の標識法に変えるのが良いと思います。過去の研究を見ると、biotinおよびstreptoabidinの構造を改変して内在性のbiotinとは反応しない改変型streptoavidinで行っている研究もあるようです。

(無題) 削除/引用 No.12471-7 - 2024/07/28 (日) 15:46:29 - G25 いや待て待て、 ビオチン化処理したタンパク質と内因性のビオチン化タンパク質が同時に泳動されているなら、内因性のだけブロッキングするのは無理な話。 ビオチン化処理と非処理のコントロールで差分を取るしかないのでは

(無題) 削除/引用 No.12471-6 - 2024/07/28 (日) 11:57:58 - LPS G25さんがおっしゃっているように内在性のビオチン化タンパク質だと思います。 サンプルの調整でどのようにビオチン標識をされているのかわかりませんが、内在性のものを先に不活化できない限り、ブロック剤で対応するのは不可能ではないでしょうか。 当方は、一次抗体がビオチン化抗体で、SA-HRPで検出する系でしたが、内在性のものをSAでブロックしたりしましたが、うまくいかず断念しました。紹介されている試薬は組織染色には使われていますが、ウエスタンには量的な問題（コスト的な）もあり、試してはいませんが。

(無題) 削除/引用 No.12471-5 - 2024/07/28 (日) 06:44:24 - G25 どういうサンプルなのかわかりませんが、生体内に元々、内因性のビオチン化タンパク質があることをおわすれでは？ つまりノンスペではないのかも。 すでに言及しされているような内因性ビオチン専用のブロッキング剤がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12471-4 - 2024/07/28 (日) 00:53:07 - おお どちらのSAを使っているのかわかりませんが、まず、希釈倍率を上げてみてもいいんじゃないでしょうか。私は確かピアスのやつを使ったことがありますが、実験系は全く違いますが20,000から50,000倍で使ってました。 ブロッキングについてはDenhardt′s Solutionを使ってました(核酸検出でポジティブナイロン膜でしたけど)。成分はBSA、フィコール、PVPです。なのでPVPをお使いのブロッキング液に加えるぐらいでもいいかもしれません。 また、ビオチンとストレプトアビジンの結合は非常に強固なのでデタージェント、塩濃度もいじれます。私は上記の実験で1％TRITON X100、1M NaClでやってました。ここまで極端でないにしろTRITONとかデタージェントを変えて疎水的なのノンスペを落とし、塩濃度をあげて非特異なイオン相互作用を切ると言ったことはできると思います。 因みにヘモグロビンがあると、HRPが無くてもケミルミでひかると聞きますが、組織のサンプルならそう言うのが顕著に出る場合があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12471-3 - 2024/07/27 (土) 22:32:16 - egeria 「BSAでブロッキング→BSAで反応」だとバックグラウンドが高すぎるという場合、「スキムミルクでブロッキング→BSAで反応」とすると改善される場合があります。 https://www.tandfonline.com/doi/full/10.2144/btn-2018-0006 ビオチンを多量に含むスキムミルクはストレプトアビジン使用時のブロッキング剤に適しませんが、ブロッキング後washすればビオチンは残留しないようです。BSAよりスキムミルクのほうがはるかに強くブロッキングできるので、ノンスペに困っているなら一つの選択肢かと思います。

(無題) 削除/引用 No.12471-2 - 2024/07/27 (土) 22:31:03 - あの 次あたりはどうですか？ https://www.funakoshi.co.jp/contents/69647

HRP-streptavidinのお勧めblocking剤 削除/引用 No.12471-1 - 2024/07/27 (土) 19:07:38 - HRPSA お世話になります。 早速ですが、SDS-PAGE後にbiotin化タンパク質の検出をHRP-streptavidin (SA)で行っています。 具体的には電気泳動後、PVDF膜に転写、その後、軽く濯いで、3% BSA in PBS-Tで揺らしながら4度で一晩十二分にblockingしています。 その後、1:2000希釈のHRP-SA in same blocking bufferで45分、室温インキュベートしたのち、十分洗浄後、ECLにて検出しています。 ただ、biotin化しないはずのコントロコールでも多くのバンドが数秒で認められ、しかしbiotin化を期待しているサイズでは、そのバンドが特異的に見られていることから、検出はうまくいっているが、ノンスペが多い、と考えております。 3% BSA in PBS-T以外におすすめのblocking剤をご存知でしたらシェアいただけると嬉しいです。

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