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(無題) 削除/引用 No.12701-5 - 2024/11/26 (火) 08:58:28 - おお totoさんに示していただいているようなメカニズムがベースになっていますので程度の違いはあれどクロマトグラムでみて裾が広がったようになります。 よく２相分配の説明がよく使われます。以下のリンクの図3、４を見ると良いでしょう。 https://hr-inoue.net/zscience/topics/chromato/chromato.html ただグラジエントなどをかけたときは図の説明をもとにすると水相への溶け込みを徐々に良くしていくようにしていますので、有機相に溶けやすいものでもそこにとどまったまま動かないということはなく遅れて移動するようになります。 アフィニティーといっても色々ありますし、いきなりほぼ外れるような条件にすると比較的裾野広がりが狭いです。 塩濃度、イミダゾール濃度、グルタチオン溶液をステップワイズカラムに乗せても境界付近は容易に拡散して滑らかな勾配になりますので少量が先行することも考えられるかと。 もう一つの要因はアフィニティーの相互作用以外に支持体と相互作用がいくらかありそのために遅れて出てくるものが見られる場合です。テーリングとも言うかもしれません。 テクニカルに言えば１フラクションの容量を増やせば１本に収まるようになりますが、精製度を上げるためにはそれよりもある程度細かく取ったほうが夾雑物が少ないフラクションの回収が可能になります。

(無題) 削除/引用 No.12701-4 - 2024/11/25 (月) 20:03:35 - 2 1. 今よりももう少しカラムの径を太くしてみたらどうですか。 2. グラジエントで溶出してるなら勾配をより急にするか、ステップワイズ溶出ならば、bed volume くらいまで溶出用bufferを流したらいったん出口を止めて15~30分くらいおいてからゆっくり溶出してみるとまとまって出てくることはよくあります。 3. タンパク質のアイソフォームとかでもともとリガンドに対する親和性が異なる成分が混在しているのかもしれない。親和性の強さが様々な抗体が混じってるポリクローナル抗体とか抗血清を抗原カラムで精製するとそんなふうに解釈できることがたまにある。初めの方に溶出してくるのは親和性が弱いもので、後から出てくる方は親和性が強いとか。もしそうならば、それはそれで重要な知見になると思うので、やみくもにフラクションをプールせずにフラクションごとに電気泳動とかウェスタンとか、抗体ならば各溶出画分を使ってドットブロットとか抗原との親和性をみて見るといい。

(無題) 削除/引用 No.12701-3 - 2024/11/25 (月) 20:01:16 - toto ビーズに結合してるリガンドと結合したタンパクが、フリーのリガンドを含む溶出液を加えたときになぜだらだらと出てくるのか、ということでしょう？私もなぜかなと思ったことがあります。 定性的に言えば、結合したタンパクは固定化リガンドと平衡状態にあるわけですが、そこに溶出液が来ると、その平衡が壊れて、フリーのリガンドとも平衡状態になり、ビーズから離れるタンパクが出てきます。どれくらい早く離れるかはグリーのリガンドの濃度と解離速度koffによりますが、カラムクロマトの場合は、一旦離れても、近くにいるビーズと再び平衡状態となり、ということを繰り返すので、カラムからでるのが遅れて、だらだら出てきます。拡散が結合反応と共役することで、こうなります。 反応化学の教科書を見ると式付きで書いてありますので参照ください。

(無題) 削除/引用 No.12701-2 - 2024/11/25 (月) 19:14:26 - qq カラムサイズが大きすぎる。 溶出液の流速が大きすぎる。 溶出液の条件が緩すぎる。 クイズじゃないんだから、可能な範囲で詳細を書きましょう。

アフィニティクロマトグラフィーについて 削除/引用 No.12701-1 - 2024/11/25 (月) 18:18:56 - G アフィニティ溶出後のフラクションについてなのですが、一本にタンパク質が集まらず、複数本に分散してしまうのは何が原因なのでしょうか？ なにかアドバイスよろしくお願いします。

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