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(無題) 削除/引用 No.12799-6 - 2025/01/24 (金) 16:39:49 - あああ 思い当たるqPCRでは差が出ないので、RNAseqをやるしかないけど48時間目で良いですか？ という質問で、遺伝子情報も変異情報も無しに答えるのは無理でしょう。情報は出したくないけど、考えてくれって感じで好かん

(無題) 削除/引用 No.12799-5 - 2025/01/24 (金) 14:01:29 - おお >またqPCRで何か目途の立つ遺伝子もないので、 これはWTと変異体での比較ですか？ WTと発現していないコントロールではなにか変化が見られてませんか？見られているなら少なくともWTの発現による効果が見れるタイミングはわかると思いますが。その状況で変異体ではどうなっているのかという実験の組み方はできるかもしれません。 実際確かに理屈を積み上げてデザインするには情報が少ないことはあります。そのうえでなるべく直接的な影響を中心にみたいなら導入の影響が残っていない、発現がピークと言わないまでもしっかり確認できるタイミングというのがあり得る選択肢です。 なんとなくInteractome（Proteomics)を先にやったほうがいいような気がしてきました。そうすればどんな遺伝子を指標にして回収するタイミングを決める材料が増えそうなきがします。というかInteractomeなどのデーターベースで調べられそうだけど。

(無題) 削除/引用 No.12799-4 - 2025/01/24 (金) 07:48:53 - おお >その後Integrationするでしょうけどこれは分裂時に起こるんでしたっけ。 あ、おもいだした。レンチは分裂しない細胞でも発現できるので分裂時に起こるというのは（効率などに影響出るかわからないけど）、違いますね。

(無題) 削除/引用 No.12799-3 - 2025/01/23 (木) 05:52:26 - おお http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=12773 似たような質問がありました。これがあなたかどうかは置いといて、状況がちょっと違うような気もします。 前の質問でうさんの回答と同じようなことを書いたかもしれません。 ＞長時間培養に伴う無関係な差異のリスク 長期間培養で無関係に差が出るっていうのがどうもよくわかりません。２次的な変化などが交じるってことですか？２次的な変化もその遺伝子によって引き起こされるものです。なので意外とそっちのほうがその遺伝子（変異）の役割が見やすいかもしれません。例えばその変異がある病気におけるものなら、変異が起きて４８時間後に、ハイ病気とはならないですよね。長い期間における変化が病理に関係しているかもしれません。 ちなみに私はKDをレンチでやったとき感染後ピューロマイシンで選択しながら４８時間培養して回収して実験したことがあります。HEKなら感染効率はほぼ１００％ぐらいに持っていけるのでほとんど細胞は死にませんでした。感染効率が見積もられているのならピューロマイシン選択は必要ないか判断できるのではと思いますが。私の場合はピューロマイシンかけても選択が目に見えて起こっている用に見えなかったので感染効率がたかく選択しなくても良かったのかなっていうぐらいでした。 ＞論文を見ても人それぞれという感じです。 それはどういう意味だと思いますか？おそらく実験する際にいつがいいか、現実可能かなど実験毎に違ってそれぞれの実験で度のタイミングがいいか決めているからではありませんか？細かく書いてないことも多いと思いますが、実験をするときに度のタイミングがその実験でベター（ベスト）か普通は考えてからやると思います。 もしめぼしい物の変化が見られてないのなら、そのHEKにおいてまず発現をKD、KOするなりしてそのうえで研究対象の遺伝子（Wtと変異体）を発現させてみてもいいかもしれません。 感染直後の細胞への影響ですが、グーグルでAIが答えてくれるので（それだけでは正確でないでしょうから）、それを下にリファレンス、もう少し具体的な絞り込みの検索などで確認してみてください。 感染からDNAへの変換は意外と早いようで数時間のようですし、その間にRNAゲノムは消失するようです。その後Integrationするでしょうけどこれは分裂時に起こるんでしたっけ。そうなら１日は待たないとですが確認してみてください。感染時に膜にとどまるVSV-Gなどは二、三日経っても一定量は検出されているようです。あとは細胞の防御的反応がどの程度起こるかですかね。

(無題) 削除/引用 No.12799-2 - 2025/01/22 (水) 17:41:09 - う 遺伝子機能やその変異が見つかった経緯を書かないと答えようがないですけど、 ４８時間後に回収するとして、発現している細胞だけ回収するとか発現の均一性とか保証できますか？ 転写因子とかその上流因子ではないかと想像しますが、ホモログの論文で時間を推測できないのでしょうか。とはいえ、サイトカインの発現誘導でも遺伝子毎にタイミングは違うので、一点でなんとか網羅しようとするのは厳しいかもしれません。

レンチウイルス感染後の解析のタイミング 削除/引用 No.12799-1 - 2025/01/22 (水) 07:17:22 - One 以前似たような質問をしたのですが、判然としなくなったので改めて質問させていただきます。 現在、HEKで遺伝子変異の機能解析を行っています。変異ありとなしの遺伝子をレンチで導入しています。 これらの細胞をRNA-seqやトランスクリプトーム解析をする予定ですが、そのタイミングで悩んでいます。2つ案があります。 一つは、感染後48時間後くらいに、細胞を回収して解析する案、もう一つは、puromycinセレクションも加えてから解析する案です。 感染48時間後は2群で同じとは言え、細胞はウイルス感染の影響も受けていると思います。しかし、代償反応も少ないと思いますし、長時間培養に伴う無関係な差異のリスクは最小化されている気がします。 一方、puromycinセレクションをかけてからの方がいいのでしょうか。 論文を見ても人それぞれという感じです。またqPCRで何か目途の立つ遺伝子もないので、RNA-seqにいきなり飛び込まざるを得ないと思っています。

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