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(無題) 削除/引用 No.12805-6 - 2025/01/30 (木) 05:12:48 - おお >隣のレーンのサンプルが侵入するといったことは考えられますか？ ゲル板があまりきれいでないばあい、ゲルとの接触面であまりうまくポリメライズがおこらずそこから横に広がることがあります。この減少は特にスタッキングと分離ゲルの境で顕著です。局所的でなければマーカーとかも隣のレーンに侵入しているので（顕著なばあい）、それを疑う根拠になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12805-5 - 2025/01/28 (火) 04:01:39 - おお https://www.researchgate.net/figure/Analysis-and-identification-of-the-environmental-protein-contaminants-Silver-stained-SDS_fig2_6185847 感度が良かったり泳動そうが汚れたりするとケラチンが見えることがありますね。動物で抗体作るときケラチンの抗体が混じったりするので。そういうのはサンプルを入れてないレーンでもバンドが出てきます。

(無題) 削除/引用 No.12805-4 - 2025/01/28 (火) 02:04:45 - 4567 抗体を買い直して（可能ならばlot Noも同じものを指定すべき）やり直すのが正攻法であり一番良い解決法と思います。 ただ、今あるデータで、ということでしたら、エクストラバンドが非特異的な反応に起因する可能性があるならば、本来の抗原タンパク質のシグナルのみ定量して構いません。というか由来のよくわからないシグナルまで含めて定量してしまうと、それは誤った解釈につながります。Figではデータはメンブレン全体（or 少なくともエクストラバンドも見える形で）を示して、よくわからないバンドについては図中にアスタリスクをつけて、``アスタリスクはnon-specific signalsとかunidentified を示す``とかの記述をFigのキャプションの中に加えれば良いと思います。得られた結果は隠さずに全部見せるのであとは読者の方で判断してくださいということも一つのやり方です。読者やレビュアーの中にはそこから著者の気が付かなかった新しい可能性や仮説を引き出せる人がいるかもしれません。そうなれば、あなたのそのデータは貴重な科学的貢献をすることになります。 Western blotのFigで、サプリメンタリーに、切り抜きしてないメンブレン全体の写真を載せているものが上位誌を中心に増えていますが、そうしたものを見ていると、実際には対象となる抗原タンパク質以外にも複数の（時には本来の抗原タンパク質よりも）強いシグナルが検出されてしてるのは時々見かけますが、それらについて明確な説明はしていないことが多いです。良いことかどうかは別にしてレビュアーも補助的データまであまりちゃんと見てない人も多いのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12805-3 - 2025/01/27 (月) 12:04:18 - み 交差反応で本物の標的蛋白以外のバンドが出ることがいくらでもあります。 ２次抗体だけで反応させてもexposeの時間をある程度長くすると幾らでも出てくるでしょう。 コントロールサンプルとの差がないくらい出るとのことですが、標的蛋白の分子量領域に着目しても差がないのでしょうか？ コントロールが何なのか知りませんがKnockoutサンプルかKnockdownサンプルなら消失・減弱してしかるべきでしょうが、non-transfectantなら内在性が出てもおかしくない。 まあ、そもそもその抗体の特異性や、以前に検出されたバンドの特異性から検証した方が良さそうな話に聞こえます。 色々とnegative control, positive controlをとりましょう。 抗体は冷蔵していれば数年は大丈夫なことが多いです。 １０年前の抗体でも大概いけます。

(無題) 削除/引用 No.12805-2 - 2025/01/27 (月) 11:53:11 - 4567 抗体については、（全ての抗体がそうだというわけではないのですが）劣化してくると、本来の抗原タンパク質以外によくわからないシグナルが出現することがたまにあります。原因はわかりませんが、例えばもともと構造の類似したタンパク質があって交差反応するとか、あるいは単に非特異的に反応するタンパク質があって、購入初期は本来の抗原分子に対する反応性が高くて短時間のexposeで検出できたので、そうしたマイナーなシグナルは目立たなかったのが、抗体の劣化により、本来の抗原タンパク質の十分なシグナルを得るのに多少時間がかかるようになりexpose時間が延長した結果、短時間のexposeでは出なかったようなシグナルが次第に目立つようになってきたのかもしれません。 ただ一般的には抗体はとても丈夫なタンパク質ですので、適切な保存条件であれば、例えば4℃保存で購入後１~2年以上使えてるものも普通にあり、保存期間が長くなることでそんなに簡単には変になることはあまりないので（ただし、一旦劣化が始まると急激にダメになりますが。）、もともと潜在的に非特異的なシグナルが出やすい抗体だったのかもしれません。

ウェスタンブロットで複数のバンドが検出される 削除/引用 No.12805-1 - 2025/01/27 (月) 10:34:37 - よげむ お世話になります。 当方、7月ごろに一度ウェスタンをし、今回N数を取る必要が出たため再度行なっています。しかし、7月ごろにやった結果と異なり、複数のバンドが出現する、コントロール(タンパク未発現のはずのレーン)でもバンドが出現しレーン間の差が見られない　といった状態に陥っています。 そこで、手技的問題以外でどういったものの影響が考えられますでしょうか？ 例えばゲルが緩くて隣のレーンのサンプルが侵入するといったことは考えられますか？ また複数のバンドが見られた際の解析はどのようにしますか？恣意的にバンドを除いてはいけないと思うのでレーンあたりの全てのバンドを選択して定量しようと思っていますが皆さんならどうされますでしょうか？ よろしくお願いします。 ※エアコンは常に動いてるため温度の影響は少なそうです。熱変性はタッパーに沸騰させたお湯を入れ、5分くらいサンプルをつける形で実施してます。試薬の劣化が可能性高いと思っています。

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