BioTechnicalフォーラム [qPCRなどでのトリプリケート]

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(無題)

No.12841-13 - 2025/02/25 (火) 03:09:42 - ｃ

例えばもう一セット、特にばらつきが見られるところをやって最終的にn＝４にするとかもできるわけだし。

だから言ってるじゃないですか？なぜとりぷりけっとか？自問自答したら答えは出ると。それすらも自分で考えられずに漫然と作業をしているのであれば100wellすればいいんですよ。

(無題)

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No.12841-12 - 2025/02/25 (火) 02:10:57 - おお

>Rawデータとして残すものとデータとして採用するものは違いますよね？
当然色々な状況を考慮の上にデータの採用不採用は決まると思います（これは議論にふんわりと混ざっているバイアスや不正とは全く別物です）。

バイアスとは違うといいますがその差別化がよくわかりません。

＞そういう方々は100wellで測定することをお勧めしますよ。

その他にもやりようがあるので極論にしかいかないのはなぜでしょうか。
例えばもう一セット、特にばらつきが見られるところをやって最終的にn＝４にするとかもできるわけだし。

(無題)

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No.12841-11 - 2025/02/25 (火) 02:05:44 - おお

>たとえば、n=3として、その中の2点だけを採用するというルールにする

わたしはこの線が妥当かなとおもいました。

(無題)

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No.12841-10 - 2025/02/25 (火) 01:13:53 - E

>[Re:1] あさんは書きました :
> 普段qPCRなどを行う際、1つのサンプルを3wellで解析、いわゆるトリプリケートを行い、その平均値をn=1として扱っています。
> テクニカルエラーなのか、2つはほぼ同じ結果で、1つは大幅に異なる結果が出ることがあるとします。
> この場合、結果は結果なので異なる数値が出たとしても3つの平均を取るのが筋かとは思いますが、数値に差があれば平均値も変化してしまうため、理想のデータではない気がします。
> この場合、qPCR自体をもう一度やり直すのか、外れ値が出た場合やむを得ず外れ値を除外したデータを(2well分の平均にする)など、皆さんはどのように対応していますでしょうか？

たまにありますね。私でしたら、とりあえずこのサンプル（n=一番目）ははずれ値がでた、たぶんテクニカルエラーによるものだろう、と考えておきます。で、同じサンプルでもう一度qPCRするか、あるいは同じサンプルを作り直して、n=二番目として結果をみます。これでこれで前回の外れ値がテクニカルエラーだったのかどうかを考えます。

あと研究的にはこのqPCR結果が全てではないですよね。他のアッセイや実験も含めて結果を見て、総合的に判断します。

(無題)

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No.12841-9 - 2025/02/25 (火) 00:00:37 - ｃ

Rawデータとして残すものとデータとして採用するものは違いますよね？
当然色々な状況を考慮の上にデータの採用不採用は決まると思います（これは議論にふんわりと混ざっているバイアスや不正とは全く別物です）。その採用不採用の過程は頭なりノートなりに残りますよね？

いろいろと言ってる方々は、研究を自分の頭ではなく、誰にも文句を言われないようにデジタルでやりたいと思ってるのだと思いす。そういう方々は100wellで測定することをお勧めしますよ。well数を増やすほど外れ値が出現する可能性は増えますが、100wellも平均すれば外れ値をノーマライズしたり統計で除外が十分に可能かと思います。
お金も時間も飛びますが、世界中の誰も文句の言えないデータになります。ちなみにお金（当然時間も）はあなたの私財ではなく税金ですが、24時間働いている我々研究者に、そんなことは関係ないですよね。

(無題)

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No.12841-8 - 2025/02/24 (月) 18:42:11 - 774R

qPCRはやったことありませんが、ELISAではいろいろな理由で外れ値が出ることを経験します。
隣のwellからの混入とか、泡とか、プレート底面の汚れとか、原因が特定できないけれども、１点だけ直線から外れたりすることはたまにあります。

たとえば、n=3として、その中の2点だけを採用するというルールにすると、かなりの確率で上記の影響を受けずに済むと思ったのですが、これはありですか？（研究倫理的に）

nを増やして外れ値検定を。

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No.12841-7 - 2025/02/24 (月) 18:31:29 - 2

元々が同じ検体ならば(実際はともかく原理的にはほぼ同じ値になるはずなので）大きく離れた測定値のどちらかが正しくないので、機械的に三つを無理に平均すると誤った結果になると思います。n=3では無理ですがn数をもっと多くした上でスミルノフグラッブス検定で外れ値を検出して（自己判断で外れ値と判断して除くのはダメですが、検定すると大抵は自分で外れ値ではと思ったものが外れ値として検出されます。）これを除いた上で平均すればそうしたリスクは回避できるともいます。

(無題)

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No.12841-6 - 2025/02/24 (月) 08:55:33 - qq

３つの測定値の中央値を代表値にするのはどうでしょう？

(無題)

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No.12841-5 - 2025/02/24 (月) 07:18:05 - おお

>[Re:4] ｃさんは書きました :
> へ？なんでトリプリケートでqpcrを行っているんですか？100wellで解析してn=1にしますか？
> 自問自答したら答えは出ると思いますが？

テクニカルmulti-cateの場合考え方としてピペッテイングなどの誤差を吸収すると同時に誤差から明らかに逸脱したデータをはじくと言った事も考え方としてあります。そう言う主張なのでしょうか？じゃあどの程度を外れちとするかも指摘していただければと思います｡

開き直って３ウェル使って全てサンプルで平均から一番遠い物を省いてduplicate にしてしまった方がスッキリするかもです｡これはやっちゃいけないと言う指摘もあるし場合によっては誤差が大きくなるかもしれませんが、バイオロジカルトリプリケートではないのでなんらかの生理的な事象を無視しているわけではないので。

(無題)

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No.12841-4 - 2025/02/24 (月) 02:19:55 - ｃ

へ？なんでトリプリケートでqpcrを行っているんですか？100wellで解析してn=1にしますか？
自問自答したら答えは出ると思いますが？

(無題)

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No.12841-3 - 2025/02/22 (土) 09:15:57 - ふみ

3重測定なら外れ値を含めて平均値を使うのがよいように思われます。
5重測定で1つだけ明らかな外れ値なら除きたくなる気はします。

やや脱線しますがバイオロジカルマルチプリケートなら10あっても(n=10でも)外れ値を除外すべきでないと考えています。

(無題)

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No.12841-2 - 2025/02/22 (土) 07:38:18 - おお

悩ましいところですね。理屈では同じ数字が出ると言う事ですから、ハズレ値は除いてもいいと言う人はいると思います。私は昔は全部使うべきだと主張していました。Outlierを統計的に検出する方法がありますが、そういうのを使えば無難なのかもしれません。ただ本当はサンプルサイズが数十ないと検出力は出ませんから（６以下では使うなともいわれている）。感覚的にこれは外れているなとなるとどれだけ離れていたらという基準で悩むことになります。経験的にこれ以上は離れないという基準が置けるならいいのかもしれません。

少なくともそのサンプルで２WellぐらいでqPCRするのがいちばんもやもやしないと思います（毎回で数字がブレないなら）。

qPCRなどでのトリプリケート

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No.12841-1 - 2025/02/18 (火) 17:17:01 - あ

普段qPCRなどを行う際、1つのサンプルを3wellで解析、いわゆるトリプリケートを行い、その平均値をn=1として扱っています。
テクニカルエラーなのか、2つはほぼ同じ結果で、1つは大幅に異なる結果が出ることがあるとします。
この場合、結果は結果なので異なる数値が出たとしても3つの平均を取るのが筋かとは思いますが、数値に差があれば平均値も変化してしまうため、理想のデータではない気がします。
この場合、qPCR自体をもう一度やり直すのか、外れ値が出た場合やむを得ず外れ値を除外したデータを(2well分の平均にする)など、皆さんはどのように対応していますでしょうか？

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