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コメントへの御礼 削除/引用 No.12856-7 - 2025/03/17 (月) 14:45:11 - ミンオナ montさん 丁寧にプロトコルをまとめていただいてありがとうございます。 プロトコル、クライオスタッドの設定含めて参考になりました。本当にありがとうございます。 emaさん 川本法のシールについて初めて聞きました。その後の染色には問題ないため試します。コメントいただき、ありがとうございました。 ふみさん コメントいただき、ありがとうございました。馴染みについてもう一度見直し指摘いただいた方法を実践致します。

(無題) 削除/引用 No.12856-6 - 2025/03/11 (火) 03:53:49 - mont 私の場合ですが、 １）スクロース・PBS液から取り出した後、濾紙またはペーパータオルの上を転がし、組織についている溶液を完全に取り除きます。狭い隙間にも注意して、徹底的に溶液を吸い取ります。 ２）OCTにゆっくり入れ、OCTの中で泡が立たないように注意しながら、ピンセットで組織をくるくる回転させます（３０秒〜１分ぐらい）。 ３）OCT溶液から組織をゆっくり取り出し、濾紙の上でゆっくり転がします。 組織にまとわりついたOCTを軽く落とす感じです。この時は多少OCTがまとわりついていても大丈夫です。 ４）新しいOCTに移し、ゆっくり沈め（ほぼ自重で沈ませる）、泡立てないように中で数回転がしてから底におしつけ、ドライアイス・アセトンで底から凍結。 私も、どちらかというと温度が低すぎるのでは？と思います。実際に見てみないとなんとも言い難いのですが、組織がガリガリと削りカスのようになってしまうなら、たぶん温度が低すぎます。マイナス15度から20度ぐらいの間で試してみてはどうでしょう。うろ覚えなのですが、確か胎児は-16から-18度ぐらいで切ってたように思います。 薄く切る必要がなければ、10μとか厚めに切れば楽です。 後、組織に対する刃の角度も重要です。 私はだいたい4度〜6度ぐらいで切ってます。また刃の固定が甘いとうまく切れません。 以下、パラフィン切片の場合ですが、基本は同じです。 https://www.leicabiosystems.com/en-ca/knowledge-pathway/knife-angle-in-microtomy/ もしアンチロールプレートをお使いでしたら、このプレートの位置が非常に大事になります。ガラスの欠けがないか、また位置を慎重に合わせる必要があります。刃よりほんのちょっとだけ前に出し、かつ切る時に組織に当たらない位置で、切片がスッと間に入る位置です。 固定時間16〜20時間は、妥当な時間だと思います。脳が重要なのでしたら、脳を露出して固定するのも良いです。PFAは浸透速度が遅めの固定液なので、5ミリ以上の厚さがあると中心部の固定が甘くなります。 庫内の温度、刃の角度と固定具合、アンチロールプレートの位置 まずは以上を確認してみることを、お薦めします。 後は、クライオスタットの性能が悪い場合、庫内温度の上下が激しかったり、アンチロールプレートがボロボロで使えない、、、などの場合は、正直調整は大変です。 逆にクライオスタットの性能がよくて条件調整がバッチリだと、驚くほど簡単に切れます。

(無題) 削除/引用 No.12856-5 - 2025/03/07 (金) 12:20:24 - ema 技術を磨くことが先決ですが、その後の実験染色などに問題が無いなら 川本法のシールを貼るという選択もあります。 http://section-lab.jp/Japanese/Technic/Material-2.htm

(無題) 削除/引用 No.12856-4 - 2025/03/01 (土) 14:35:56 - ふみ 切片にした際にコンパウンドから組織が脱落するなら、馴染んでいない可能性が考えられそうです。 そのような場合は、スクロース液とコンパウンドを混ぜたものを用意して、そこに浸してからコンパウンドに包埋するとうまくいったことがあります。 あるいは、組織がぱりぱりした感じで折れたり破れたりするなら、下げるというより温度は上げた方がよさげな気がします。

(無題) 削除/引用 No.12856-3 - 2025/03/01 (土) 10:03:41 - ミンオナ みさん 様々な観点から助言いただき、ありがとうございます。 手技による影響の可能性も含め、慎重に検討いたします。 また、ご指摘いただいた**「コンパウンドに入れる際にスクロースin PBSを持ち込んでいて組織が馴染んでいない可能性」についてですが、もし適切な時間や方法がありましたら、ご教示いただけますと幸いです。** 質問が多くなり恐縮ですが、貴重なご意見をいただき、大変感謝しております。

(無題) 削除/引用 No.12856-2 - 2025/02/28 (金) 17:24:09 - み 無固定の個体をダイレクトに包埋して切片作製可能です。その方が免疫染色の場合は賦活化必要ないので楽です。 それが技術的に難しいというなら単に下手なだけではないでしょうか？ 生後の脳では上手く切れる腕なのでしょうか？ 温度をもう少し下げるなり、切片の厚さを厚めにするなり試行錯誤できる部分はあるでしょう。 庫内温度が表示温度と一致しているか分かりません。 コンパウンドに入れる時にスクロースin PBSを持ち込んでいて組織がコンパウンドに馴染んでいないとか。 スクロース置換しているなら固定が長すぎて問題になることはないです。

マウス胎仔脳のクライオスタット切片化について 削除/引用 No.12856-1 - 2025/02/28 (金) 14:38:54 - ミンオナ B6系統マウスのE12.5、E13.5のクライオスタット切片化について相談があります。 現在の手順として、 4% PFAで16〜20時間、全身を浸漬固定 15%スクロースに移し替え、2日間浸透 30%スクロースに切り替え、さらに2日間浸透 OCT包埋後、凍結ブロックを作製 この後、クライオスタットで切片化を試みたところ、脳の部分が破れてしまうという問題が発生しました。 対策として、 刃を新しいものに交換 クライオスタットの温度を-22℃に変更（通常は-20℃） を試しましたが、改善が見られませんでした。 固定時間（16〜20時間）が長すぎたことが原因ではないかとも考えていますが、それ以外に考えられる原因や改善策があれば、ご助言いただけると幸いです。

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