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(無題) 削除/引用 No.12864-11 - 2025/03/12 (水) 08:38:58 - おお 抗体の液量が少ないイメージがあったのですが、60μL/cm^2ならミニゲルサイズで３から４mlですよね。ならそんなに少なくないと思えます。その程度なら抗体が少なすぎて飽和とかないかなと思ってます（理論的な数字では飽和しそうですが、抗体反応液を再利用してもしっかりバンドが検出できますから）。膜をきってということは使っている容量は０．３から０．５mlですよね。抗体は多少薄めても意外とバンドが検出できますので（もちろん抗体によってはうまくいかないことも稀にありますが）、同じ抗体量でちょと溶液の量を増やしてもいいかもしれません。 ポリエチレンバッグでヒートシールしてもいいですが、１５mlチューブとかできればもう少し小さめのチューブにいれて、チューブが水平になる状態でローテーションさせるというてもあります。 あるいはポリエチレンでチューブ状になったやつだとシワとかでむらにならないかもとも思えます。 https://www.uline.com/Product/Detail/S-3520/Poly-Tubing/2-Mil-Poly-Tubing-Roll-1-x-1500?pricode=WB0353&gadtype=pla&id=S-3520&gad_source=1&gclid=EAIaIQobChMIpove_paDjAMVXUL_AR0yZS_zEAQYASABEgLlM_D_BwE 液量的にそんなに少くないと思えてきましたので、なんか原因が他のところにないかとか思い始めてます。 ちなみにPVDFでトランスファー後、乾燥させて抗体反応させると蛋白のついている部分だけ抗体がアクセスできるのでバックが低くなるっている謳い文句の方法もあります。少ない抗体反応溶液のばあいこちらのほうがもしかしたらいいのかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12864-10 - 2025/03/12 (水) 08:30:12 - TS ムラとはどのような感じでしょうか。全体的に右、左、真ん中のどこかが濃い・薄いとか、あるいはそのような規則性はなく、濃い・薄いがばらばらと現れるとか。それによって、トラブルシュートのポイントが絞れることがあると思います。 みなさんがコメントされている染色はもちろん重要ですが、転写ムラはないかなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.12864-9 - 2025/03/12 (水) 07:47:50 - ケチ うちは1次抗体溶液とともにポリエチレンのバッグにヒートシールして、おおさんがお書きになっているように2枚のガラス板に挟んでクリップで強くとめています。こうすると2枚のがラス板が平行になって、それに挟まれたバッグがきれいに伸びるせいで、ギリギリの量の抗体溶液でも中でメンブレンが泳げるようになります。

(無題) 削除/引用 No.12864-8 - 2025/03/12 (水) 06:44:10 - mont GAPDHの染色ムラは、バンドの中心が白く抜ける感じですか？タンパク量が多すぎると、ECLの発光基質が部分的に大量に消費され、発光出来なくなって白く抜けたようになることがあります。 アプライ量を減らす、一次抗体を限界まで希釈する、感度の低いECLにするなどの対策が可能かと。 抗体を節約したい気持ちはわかりますが、単純に全体の液量を増やすという選択肢はないのでしょうか？ よほど高価な抗体でない限り、私のラボでは一次抗体は10ml作るのが一般的です。 メンブレンのサイズに合わせた密閉容器に入れて震盪します。 ミニゲル2、3枚に充分な量、1枚ならたっぷりな量です。最低でも3mlぐらいは作るかな？って感じです。 ローディングコントロールなら、普通抗体の単価も安いですし、アザイド入れて何度も繰り返し使えます。なんなら1年ぐらい同じ抗体希釈液を繰り返し使ってたりします。ハイブリバックに入れて、とか、ギリギリの液量で、、、うまくいっているのなら良いのですが、そうでないならトラブルシュートにかかる時間がもったいないような気がします。経験上、ほとんどの抗体は、説明書に書いてある推奨濃度の倍以上に希釈してもワークしますし。 2次抗体も10mlに1マイクロで使い捨てです。 PBSTのWashは、目分量で容器の半分くらいまで入れて、6回交換とかです。1回の実験で1リットルぐらい使い切ります。私のラボでは、みんな目分量でドバドバ使います。 ブロッキング溶液はPVA溶液使用、100ml作ってタッパーに常温保存。1ヶ月は余裕で同じ溶液を使い回してます。 今までこれが普通だと思っていましたが、皆さんはもっと少ない液量でやってるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12864-7 - 2025/03/08 (土) 00:57:57 - ウェスタン初心者 詳しい説明ありがとうございました。 研究対象のタンパク質の発現量が少ない場合、発現量の多い内在性コントロールでの補正は難しいのですね。トータルタンパク質による補正だとメンブレンを切らない分抗体溶液は多く必要になってしまいますが、最も有効な方法だと思いました。

(無題) 削除/引用 No.12864-6 - 2025/03/07 (金) 21:03:02 - JJJ ミニゲルで20マイクロg/laneですと多いほうだと思います。存在量の非常に少ないタンパク質の場合を別にすると、化学発光法ならば4~8マイクロg/laneの範囲で大抵の場合、問題なくウェスタンで十分検出できます。20マイクロg/laneですとGAPDHでしたらCBB染色したならバンドがわかるくらいの量があると思いますので、そのように大量のGAPDHが膜に転写される際に、膜への単位面積あたりの結合容量を超えてしまい膜に結合しきれないGAPDHが生じているように思います。これらが、膜に結合しているGAPDHの上に重なってのる状態になりさらにそれに抗体が結合するという立体的な構図を想像していただければと思います。PVDFの親水化等とは関係ありません。タンパク質量が多すぎて一部のabundantなタンパク質が膜の結合容量を超えていることが原因ではないかということです。この状態ですとシグナル強度は大きすぎてすでに頭打ちの状態になっており定量性がないので、内在性コントロールとしての役割も期待できません。（いわゆるhigh impact journalでも明らかにそのように見えるデータが掲載されているケースは時々見かけます。どのような実験手法も方法上の限界やピットホールがあります。westernは定量的分析はどちらかというとあまり得意ではない実験法です。でも結構できる方でもあまり意識していないことあります） 研究対象のタンパク質が検出できる範囲でなるべく少ないタンパク質アプライ量で検討することを勧めます。また上述のようなことはGAPHDに限らず内在性コントロール全般が内包する問題点ゆえ、最近は膜に転写されたタンパク質全体を染色してノーマライズすることが推奨されるようになりつつあり、色々なメーカーから染色液なども市販されています。ていうか自作もできます。もし興味あれば試してみてください。 https://www.atto.co.jp/technical_info/blotting/total-protein

(無題) 削除/引用 No.12864-5 - 2025/03/07 (金) 17:52:39 - ウェスタン初心者 おおさんコメントいただきありがとうございます。 メンブレンに抗体溶液をドロップした上にカットしたハイブリバックを乗せて静置するのは試してみましたが、あまり効果はありませんでした。 また、別の方がチップケースを乗せてるのを見て、平らなもので挟むこともしましたが残念ながら効果ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.12864-4 - 2025/03/07 (金) 17:47:17 - ウェスタン初心者 jjjさんコメントいただきありがとうございます。 ゲルのサイズは8×8cmです。 20μg/laneでアプライしています。 一般的なアプライ量の範囲内かと思うのですが、膜との結合が影響するのであればPVDF膜の親水化不足の可能性もあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12864-3 - 2025/03/07 (金) 15:15:51 - おお 数ミリぐらい入れるWB用の容器でもなんでもいいですから平らなところにMembraneをおいてその上に抗体反応液をドロップしてパラフィルムとかなんか平らなもので上からカバーするという方法もありますが、、、抗体溶液を先にドロップしてMembraneで覆ってから更にパラフィルムとか。 ハイブリバッグみたいなのにヒートシーラーとかで封入しているのですよね。アイデアとして、その封入したものを平らなガラスとかプラスティックみたいなのでハサミクリップで周りを挟むと比較的バッグの中が均一にならないかしら。

(無題) 削除/引用 No.12864-2 - 2025/03/07 (金) 13:10:36 - JJJ ２点ほど教えてください。 ゲルのサイズはおおよそでどのくらいですか。 タンパク質のアプライ量はどのくらいですか。 GAPDHは元々細胞内での存在量が非常に多いタンパク質ゆえ、泳動するタンパク質の量が多すぎると転写の際に膜の面積あたりの保持できるタンパク質量の限界に達します。膜に結合しきれないものはタンパク質の上にタンパク質が重なるような（お正月のお餅のお供えみたいな、あるいは山盛りのような）状態になります。その場合、抗体反応で抗体と結合するのは一番外側のGAPDHですが、このような位置のGAPDHは、膜に結合しているわけでなく膜に結合したGAPDHの上に不安定に乗っているだけですので洗浄操作などの際に脱落しやすく、もし脱落した場合は抗体も一緒にとれてしまいますので抗体が外れた部分はシグナルが減弱したり完全に白抜きになることもあります。このとれ方は偶発的でありランダムですので、結果としてシグナルのばらつきとしてみられるのではないかとおもます。適正な量のタンパク質を泳動することで改善できるとおもます。

ウェスタンブロッティングの染色ムラ 削除/引用 No.12864-1 - 2025/03/07 (金) 11:14:47 - ウェスタン初心者 現在実験でウェスタンブロッティングを実施していますが、gapdhのバンドの濃さが揃いません。 一つのゲルに同じサンプルを同量ずつアプライしてもムラが生じるので、転写から発色の過程の問題だと思います。 個人的には1次抗体反応のフイルムの歪みで生じるのかもと思っているのですが、液量を削減しつつ均一に反応させる方法は何かありますか？ 転写はタンク式で実施。 ブロッキング、tbst洗浄は液高2mmで振盪。 ブロッキング後、目的のバンドの位置のメンブレンを切り出し1次抗体は約60μL/cm^2の溶液とフイルムに封入して4℃O/N振盪。 2次抗体は液高3mmで振盪。 市販の検出試薬で発光させて撮影しています。

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