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(無題) 削除/引用 No.12927-15 - 2025/04/21 (月) 17:24:56 - おお フレームシフトというのは真核生物のウイルスで見られるribosomal frame shift ということでしょうか？バクテリアではあまり聞かないですね。 先ず質問のような発想はあってもいいとは思いますが、それ以外の2つのタンパクを発現させるような方法論は確立されています。単に2つのタンパクを発現したいならそういう系を使う方が確実です。 しかしそういう系ではないものをなんらかの理由で確立したいならやるのはそこまで否定されるものでもありません。バクテリアで効率的に働くribosomal frame shift が起こる配列はお持ちですか？

(無題) 削除/引用 No.12927-14 - 2025/04/20 (日) 21:04:44 - 雪ぐ 雪辱的？

(無題) 削除/引用 No.12927-13 - 2025/04/20 (日) 20:17:52 - G25 真核生物でポリシストロニックな発現を実現するのに、IRESを使って複数箇所から翻訳開始する方法のほかに、転写開始は上流の一箇所で、複数のペプチドを翻訳する方法があります。 後者ではribosomal splippageによるribosomal frame shift が先行して利用されたが(1990年代？)、よりパフォーマンスの良い 2A self-cleavage peptideが発見されてからは全く廃れて、今やP2Aがグローバルスタンダードになった感がある。 ちなみに、2A self-cleavage peptideはバクテリアでも機能すると言う幾つかの報告もあるし、バクテリア内在性のribosomal frame shift系もある。 にもかかわらず大腸菌を宿主とした発現系でこれらの系が顧みられていないのは、そもそも大腸菌の遺伝子の多くがpolycistronicなオペロンになっていて各CDSにそれぞれRBS (Shine-Dalgarno (SD)配列)をつければ事足りるからであるわけです。2Aもframe shiftも100%の効率で仕事するわけでなく、下流側のペプチドの発現が低かったり、cleavageされていない産物ができたりしますしね。 真核生物ではリボソームはまず5’ capに結合して、それから下流に向かって走査して翻訳開始配列にぶつかったらそこから翻訳を始めるというのが基本なので、ポリシストロニックな翻訳というのは例外的。 対して細菌ではRBSに直接リボソームが結合して翻訳を始めるので、一個のmRNA上の複数のCDSにそれぞれRBSがあればポリシストロニックな翻訳が容易にできる仕組み。 海外の掲示板でこういう問答を見つけた https://biology.stackexchange.com/questions/98654/are-2a-cleavage-sites-functional-in-bacteria

(無題) 削除/引用 No.12927-12 - 2025/04/20 (日) 12:39:32 - おお >[Re:10] おおさんは書きました : > 発現ベクターの構造としてはdicistronicのもの、プロモーターからの発現ユニットを2つ持っているものなどあります。 > 因みにプロモーターやターミネーターなど2セット持つという事はプラスミド内に同様の配列が繰り返し現れることになるので、プラスミドが不安定になることもあり扱いにくくなる可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.12927-11 - 2025/04/20 (日) 12:33:08 - おお 教科書読んでほしいというのは、まず用語のとらえかたが曖昧で話が噛み合ってないというのもあります。このままだと理解しないままに質問が終わってしまいます。質問の文に置いてここは間違っていると基礎レベルのことを多数指摘するのも場合によっては雪辱的になりかねません、一箇所ぐらいならまだしも(それぐらいなら勘違いとかもあるでしょうし）。 用語、遺伝子発現の基礎まで解説となると大学の授業ぐらいの規模になるので到底できません。

(無題) 削除/引用 No.12927-10 - 2025/04/20 (日) 11:42:47 - おお そういえば抗体をリコンビナントで産生する試みが色々なされてきて、L鎖、H鎖を同時に発現させないといけないのでその工夫が色々あったのを思い出しました。この場合両者の発現量が同等でないと効率よく抗体を作れません。 発現ベクターの構造としてはdicistronicのもの、プロモーターからの発現ユニットを2つ持っているものなどあります。 https://www.genscript.com/antibody-expression-in-E-coli.html MAbs. 2022 Aug 26;14(1):2111748. doi: 10.1080/19420862.2022.2111748 Full-length recombinant antibodies from Escherichia coli: production, characterization, effector function (Fc) engineering, and clinical evaluation Md Harunur Rashid PMCID: PMC9423848 PMID: 36018829 Simple recombinant monoclonal antibody production from E. coli Karen Baker et al. doi: doi.org/10.1101/2024.04.17.589891 そういえば大腸菌発現用でよく使われるpETシリーズにも2つのタンパクが同時に発現できるプラスミドがあったのを思い出しました。 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/71146

(無題) 削除/引用 No.12927-9 - 2025/04/19 (土) 18:41:25 - G25 がさんよ、 せっかく役に立とうと為になるコメントをしたにもかかわらず、 質問者が無知を棚に上げ的外れなケチをつけて、あくまで自分の考えが正当だと傲慢ともとれるレスをしたのに、おおさんはカチンときたんだと思う。（あたしもね）

(無題) 削除/引用 No.12927-8 - 2025/04/19 (土) 18:20:34 - が >おおさん、 あんたにだって、何も知らない時期はあっただろ。 以下のようなヒトを追い込むような言い方すんじゃねー。 気軽に質問できる掲示板なのに、教科書読めっていう回答はねーだろ。 自分だって教科書調べればわかる質問を連発してるくせに。 >それとフレームシフトとかそれによって別のタンパク質として発現とか、polycistronicについてちゃんと理解されてないのでは？ >英語のサイトとか言っているけど、概念を紹介するような簡単な説明しか見てないのでは？ >想像で解釈する前に遺伝学の教科書を読んでください

(無題) 削除/引用 No.12927-7 - 2025/04/19 (土) 18:15:41 - G25 知識不足の自覚はお有りのようで。 細菌と真核生物の遺伝子発現、転写開始の仕組みの違いなんて基礎生物学じゃあありませんか、 RBSはもともと細菌のものですし、オペロンのポリシストロン性を実現しているんですけど。IRESと混同している？ 手を動かす前にちゃんと勉強しておかないと無駄足を踏むかもや

(無題) 削除/引用 No.12927-6 - 2025/04/19 (土) 17:45:54 - おお >大腸菌で発現するのでRBSはやや不明瞭な状況です。 ちょっと理解できませんが、、典型的で良くワークする配列が使われってますけどね。 それとフレームシフトとかそれによって別のタンパク質として発現とか、polycistronicについてちゃんと理解されてないのでは？英語のサイトとか言っているけど、概念を紹介するような簡単な説明しか見てないのでは？ちゃんとした学術てこ記述を読まないと机上の空論になってしまいますよ。そもそもフレームをシフトして下流の遺伝子が読まれるって言う発想が驚き｡ずっと翻訳が続くなら下流の遺伝子は正しい読み枠で読まれない。 ストップコドンを入れるとそのタンパクの翻訳はそこで止まります。その下流にRBSを繋げておけば、上流のタンパクの翻訳やそのストップコドンに関係なくRBSからリボソームがリクルートされる。 想像で解釈する前に遺伝学の教科書を読んでください。

(無題) 削除/引用 No.12927-5 - 2025/04/19 (土) 14:21:26 - oyaji 貴重なご意見、ありがとうございます。大腸菌内で２つの遺伝子を発現させ、遺伝子間の影響を見たいというのが主旨です。英語のサイトでpolycistronicな遺伝子発現を見て、「できるかも」という印象です。 フレームシフトを考えたのは、「必ず別分子として発現させたい」という事情があります。２つの遺伝子の間にstop codonを入れると、「そこで発現が止まるのでは？」、あるいは「２つ目の遺伝子の発現レベルが大幅に低くなるのでは？」との不安があります。 大腸菌で発現するのでRBSはやや不明瞭な状況です。 （私は哺乳類遺伝子ばかりやって来たので、無知なだけかもしれません） 一回コンストラクトを作り、不明瞭な結果が出たら（可能性大ですが）、既知の２遺伝子を入れて、発現させようかと考えています。 Oriが違うプラスミドはコピー数が大きく異なるのが、心配な点です。

(無題) 削除/引用 No.12927-4 - 2025/04/19 (土) 11:19:24 - G25 フレームシフトとかめんどくさいことせずとも、オペロンがもともとpolycistronicですから、それぞれのCDSにRBS付けとけば良いわけで。 そのためのベクターもデザインされていて、Addgeneから手に入るものも少なくない。 https://sites.psu.edu/tanlab/polycistronic-expression/ https://www.addgene.org/browse/article/9897/

(無題) 削除/引用 No.12927-2 - 2025/04/19 (土) 10:49:23 - おお よく見るのは異なったOriのプラスミド２種類を導入するというものです。私はポリシストロニックなmRNAを使った発現系は見たことがありません（それか覚えてないか）。 Reconstitution of Arabidopsis thaliana SUMO Pathways in E. coli: Functional Evaluation of SUMO Machinery Proteins and Mapping of SUMOylation Sites by Mass Spectrometry Sachiko Okada et al. Plant and Cell Physiology, Volume 50, Issue 6, June 2009, Pages 1049–1061, https://doi.org/10.1093/pcp/pcp056 Functional Reconstitution of a Tunable E3-Dependent Sumoylation Pathway in Escherichia coli Sean P. O’Brien and Matthew P. DeLisa PLOS ONE https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038671 一つのプラスミドにT7プロモーターをタンデムに並べたのもみかけた。

大腸菌で複数遺伝子発現 削除/引用 No.12927-1 - 2025/04/19 (土) 10:21:17 - oyaji 大腸菌、プラスミドで複数遺伝子を発現したいと思います。 プロモーター１つ、複数の遺伝子をフレームシフトすれば、可能かと思いますが、ご意見お願いします。

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