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(無題) 削除/引用 No.12929-16 - 2025/04/26 (土) 01:29:09 - おお >感染効率は細胞によって全然違うので、感染させる目的の細胞を使ってタイターを測った方がいいとは思いますが、 なんとなくの疑問ですが、これ実践している人はどの程度何でしょうかね。 不便なのはA細胞に感染させるためにA細胞でタイターを測ったとして、その後B、C細胞にとなればまたタイターを測らないとと言うのがあるし、そういう細胞でタイターでどれくらいで感染させればいいとアドバイスされてもスケールが違った測り方ならその情報は役に立たない。 また動物実験のときは動物でタイターを測るのは無理がありそうだし、上記のように違うスケールで測ったものだとなおさらどれだけの量使えばいいかわからない。 ユニットとして統一しておいたほうがいいのではと思う次第です。メーカーがこの細胞ではどれくらいのMOIが必要というリストを出している場合もありますし、よく使われる細胞なら個々の細胞でタイターを決めるより、HEKで統一しておいてそういう情報を使うほうがいいと思うし、論文で書いてある情報がどっちなのかということでも混乱してしまうとおもう。

(無題) 削除/引用 No.12929-15 - 2025/04/25 (金) 09:40:17 - mp >[Re:14] レンチンさんは書きました : > タイター測定はパッケージング細胞と同じ293FTを使用しています。 > > 293FTがヘタっている場合、ウイルス感染のしやすさにも影響するでしょうか。 感染効率は細胞によって全然違うので、感染させる目的の細胞を使ってタイターを測った方がいいとは思いますが、293FTだったら感染効率が低いということはないだろうし、やっぱりパッケージングに問題ありでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.12929-14 - 2025/04/25 (金) 07:57:43 - レンチン タイター測定はパッケージング細胞と同じ293FTを使用しています。 293FTがヘタっている場合、ウイルス感染のしやすさにも影響するでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12929-13 - 2025/04/23 (水) 10:31:29 - mp > インサートの入っていないmCherry+HygroRだけ入ったベクターでもウイルス作っていますが、タイターは低かったです。 ということは明らかに細胞かtransfectionの問題です。 一個一個潰していけば解決するはず。 あと気になったのが感染させる細胞ですが、それが感染効率が低いということはないですか？

(無題) 削除/引用 No.12929-12 - 2025/04/23 (水) 08:34:27 - おお >[Re:11] レンチンさんは書きました : > 遺伝子サイズに関して > LTR間が8kbになっています。 8-10kbならそんなに大きくないです。

(無題) 削除/引用 No.12929-11 - 2025/04/23 (水) 08:09:31 - レンチン 遺伝子サイズに関して 私が扱っているレンチベクターのサイズは約10kbで、発現させたい遺伝子1.8kb以外にmCherry、ハイグロマイシン耐性遺伝子が載っていて、LTR間が8kbになっています。 そんなに大きすぎるという感覚では無かったのですが、一般的には大きい方でしょうか。 インサートの入っていないmCherry+HygroRだけ入ったベクターでもウイルス作っていますが、タイターは低かったです。 プラスミドのクオリティに関して ベクター作製＋Midiprepまでベクタービルダーに外注しており、自分で精製してはいませんでした。 調べたら使っているViraPower packaging mixが数年前に購入したものでした。個々のプラスミドpLP1/2・VSVGもラボにあったので、増やして精製して使ってみようと思います。 第二世代レンチウイルスは私のいる施設では使用不可なので使えそうにありません。 とりあえず細胞起こしてトランスフェクションやり直しを進めますが、他にも何か改善点があればお願いします。

(無題) 削除/引用 No.12929-10 - 2025/04/23 (水) 01:03:36 - おお >[Re:6] 遺伝子サイズさんは書きました : > 遺伝子サイズにウイルス力価は影響を受けます。 > あまりに大きなものだとタイターは著名に減弱します。 > 質問者のコメントによると２９３の細胞の融合があまり進んでなかったと言うことですが、パッケージングするcDNAのサイズが大きくてもVSVGが発現すれば融合は促進されると思うのですがどうなんでしょう。そのうえでRNAゲノムのパッケージングがうまくいかずからのウイルスの割合が増えてタイターが下がるのではと思えるのですがどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12929-9 - 2025/04/23 (水) 00:56:56 - おお >[Re:5] レンチンさんは書きました : > 確かにウイルスがちゃんと出来ていた時は多核の融合細胞の比率が多く汚い形態になっていましたが、今回は多核細胞は明らかに少なくパッケージ細胞の形が綺麗なままです。 なんらかの理由でTFがベストでないようですね。 ターゲットを入れたプラスミドの問題 ープラスミドのクオリティー、入っているものの性質等色々あるでしょうけど 細胞の調子 ーたまたまその時ベストでないなら、繰り返しやってみてもいいのかもしれませんが、継代しているうちに変わってきているなら新しく起こしてみてもいいかもしれません TFの時になにかいつもと微妙に違った ーこれもやり直してみれば解決するかもしれません リポフェくタミン以外でやってみてもいいかもしれません。ただあなたの手で実績があるなら無理にはとは言いません。あとはどっちが楽にベストの発現量を得られるかといったところもあると思いますが、並行してやったことがないのでなんとも言えません。

(無題) 削除/引用 No.12929-8 - 2025/04/23 (水) 00:31:25 - おお >第２世代の方がタイターが高い印象です。 これって安全面という点で今使っていいもんなんでしょうか？ 各施設のSafety officeの判断にもよるでしょうけど、、、 わたしはpLP１、２、VSVGがラボにあったのでバラでそれぞれ調製してまぜてました。

(無題) 削除/引用 No.12929-7 - 2025/04/22 (火) 13:21:34 - mp 買い直すならTakaraで出しているlenti用293Tがいいかも。 あとpackaging plasmidを変えてみるのはどうでしょう？ 第２世代の方がタイターが高い印象です。 Addgeneで手に入るはず。 ただ発現させようとしているものの影響が出ている様な気もしますが、例えば単純にGFPだけ発現させるようなウイルスでもタイターは低いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12929-6 - 2025/04/22 (火) 10:27:59 - 遺伝子サイズ 遺伝子サイズにウイルス力価は影響を受けます。 あまりに大きなものだとタイターは著名に減弱します。

(無題) 削除/引用 No.12929-5 - 2025/04/22 (火) 07:20:36 - レンチン お返事頂きましてありがとうございます。 独り言さん 知り合いにレンチベクター使っている人がいないのでとりあえず若い293FTの凍結ストック起こしなおして使って見て、ダメそうなら買い直しを検討しようかと思います。 おおさん 確かにウイルスがちゃんと出来ていた時は多核の融合細胞の比率が多く汚い形態になっていましたが、今回は多核細胞は明らかに少なくパッケージ細胞の形が綺麗なままです。 トランスフェクション試薬はFugene 4Kとリポフェクタミンを比較して明らかにリポフェクタミンの方が発現量が高かったのでリポフェクタミンを選択しましたが、他の方法も試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12929-4 - 2025/04/22 (火) 06:12:32 - おお リポフェくタミンはこの手のTF でよく使われるので、選択肢ではありますが私はリン酸カルシウムでやってました。結構強い発現が可能な方法だと昔から言われてます。ここでの議論でPEI でも結構強く発現できると教えてもらってます。PEI でやってみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12929-3 - 2025/04/21 (月) 17:10:06 - おお 293Tでパッケージングした際、293T cell は隣接する細胞と融合して局所的にシート状になります。これが起こらない場合多くに細胞がGFPなどでTFされている事が確認できても発現量が効率的なパッケージに必要な量に達成してない可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.12929-2 - 2025/04/21 (月) 13:44:07 - 独り言 普段タイターの濃度を計算はしてないのでタイターはわからないのですが、293FTのウイルス上清をそのまま感染したい細胞に加えると、セレクションしてもほぼ死細胞はでない濃度でウイルス作製してます。 で、質問のうまくいってないとのことですが、たまにウイルスの系を導入したいと聞き、私たちの研究室の方法と同じベクターをあげて、他の研究室で行うのですが、全く感染できないと聞くことがあります。 その場合、２９３FTをそのラボで持っていたりして、使用するとうまくいかないとのことで、私たちが普段使っている２９３FTを渡すと、問題なくワークするようになりました。 また、ラボ内でも、一部の学生が感染ができなくなるトラブルがでることがあるのですが、293FT細胞を元のストックまたは、現在進行形でうまくいってる学生の細胞を使うと解決することが多いです。 なので、質問者さんもウイルス感染がうまく行っているラボから293FTをもらって、行ってみてはいかがでしょうか。

レンチウイルスのタイターを上げる方法について 削除/引用 No.12929-1 - 2025/04/21 (月) 08:08:51 - レンチン レンチウイルスベクターを用いた遺伝子導入実験を計画しているのですが、作成したウイルスのタイターが低すぎて困っています。 現状10^4TU/mL程度のウイルスしか得られていませんが、最低限10^6TU/mL以上（濃縮前）のウイルスが欲しいと考えています。 今のウイルス作成方法はサーモフィッシャのViraPower packaging mixと293FT細胞、リポフェクタミン2000を使用してパッケージングしています。パッケージング細胞やプラスミド量はメーカーの推奨通りとしています。 レンチベクターに乗っている蛍光タンパク質によってトランスフェクション効率は確認しており、95%以上の293FTに導入されているためパッケージング細胞へのトランスフェクションはできていると考えています。 最終的に濃縮は行いますが、濃縮以外の方法でウイルスタイターを上げる方法をアドバイス下さい。 よろしくお願いします。

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