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(無題) 削除/引用 No.12935-7 - 2025/04/30 (水) 11:31:37 - 独り言 そもそもの質問が、CRISPR　KO細胞の場合、シークエンスを確定することが必要なのかという問いであれば、ウチはやってません。 ウエスタンブロットでタンパク質レベルで検出できなければKOとして使用しています。個人的な経験では、論文ではウエスタンの結果しか出してませんが、reviewerにシークエンスを確かめろと言われたこともないです。 もちろん、KOしただけだとオフターゲットなどがあるので、KO細胞に目的遺伝子を外来的に発現させたレスキューがより重要な証明方法になると思います。

(無題) 削除/引用 No.12935-6 - 2025/04/30 (水) 10:35:51 - NGS PCR産物を末端リン酸化するか、プライマーに制限酵素サイトを導入しておくかしてライゲーションしてコンカテマー（？）を作っておいて、それをクローニングしてNGSとか？

(無題) 削除/引用 No.12935-5 - 2025/04/30 (水) 10:15:39 - AA TIDEとかICEのようなサンガーの波形ファイルベースでの解析はバルクの解析では一般的ですが、精密に解析を求められた場合は不適なような気がします。 すでにご指摘ある通り、複数の異なる改変があった場合に配列決定ができないからです。 なので本当に正確に配列決定したいのであれば、やはり古典的な方法論にせざるを得ないかと思います。 カリオタイプが複雑とはいえ、(シングルクローンにしてある前提では)基本的には数種類程度の有限の組み合わせしかないはずですので、調べればそれほど苦も無く同定できると思います。 NGSだとロングリードじゃないと特定できなそうでむしろ大変そうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.12935-4 - 2025/04/29 (火) 02:52:57 - おお 私もちょっとTIDEで完全にわかるかという点ではちょっと懐疑的です。例えば両方のアレルにインサートがある場合その部分ではどちらのアレルに振り分けていいか結論が出ないので。その他にも考えたら完璧でなさそうという例が挙げれそうですが机上の空論になってしまうかもしれませんので置いときますが、TIDE制作者とかに問い合わせてもいいかもしれません。論文でDiscussionしてるかな？ 配列を決める手としては、クローンにしてからの他にnext-generation sequencing (NGS)を使うという話は確かに聞きます。

(無題) 削除/引用 No.12935-3 - 2025/04/28 (月) 19:34:05 - CRISPR maru様 ありがとうございます。 実は私もTIDE解析はしているのですが、±10塩基のindelなら解読可能ですが、そうでないならわからないままではないかと思いまして、sangerで読むべきか、けどそれだと手間がすごいし・・と思ってトピックを立てさせていただきました。 maru様は、TIDE解析だけで十分信用できそうでしょうか？レビュアーにクレームが来ないかそこは心配ではあります。 例えばTIDE解析のリンクで、Load example dataをクリックすると例の結果が出てきますが、全ての数字を足しても93%ほどです。7%は不明（黒いバー）になるのかと思います。それでもいいのでしょうか？ ちゃんと読む必要はないのかなというのが質問でした。 わかりずらく大変申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.12935-2 - 2025/04/28 (月) 14:04:55 - maru うちではTide（http://tide.nki.nl）を利用しています。 KOのシーケンスデータから、Indelの種類と頻度を推定してくれます。 Togo TVに使い方の説明動画があります↓ TIDE を使ってゲノム編集で生じたIndelを解析する https://togotv.dbcls.jp/en/20210423.html

ゲノム編集の調査方法について 削除/引用 No.12935-1 - 2025/04/27 (日) 20:05:07 - CRISPR よろしくお願いします。 私は293T細胞においてCRISPR-Cas9によるとある遺伝子のノックアウトを作製しています。 ウエスタンブロットによるスクリーニングの結果、いくつかKOが採れてきましたが、indel変異を詳細に調べる必要がでてきました。 293Tはdiploid細胞ではないことは承知です。 また、ゲノム編集領域を挟む形でゲノムPCRを行い、direct sequencingにより波形がぐちゃぐちゃになっていることは確認しています。 このPCR産物をTAベクター等にクローニングして、sequencingをすれば正確なindel変異が読めるかとは思いますが、2025年現在、そのような目的のために上記の（古典的な？）方法は第一選択になりますでしょうか？ もしかしたらadvancedな技術を使って、スマートに結果がわからないものかなと思った次第です（NGSなど？）。 ご教示いただけましたら幸いです。

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