BioTechnicalフォーラム [マウスの組織のフローサイトメトリー]

マウスの組織のフローサイトメトリー

No.12976-TOPIC - 2025/05/29 (木) 12:47:19 - Canget signal

マウスで炎症を惹起し、組織を回収し、フローサイトメトリーを行っています。

基本的な抗体として、Cd3とCd19を入れていて、それぞれ蛍光はBV421とAlexa488を使っているのですが、なぜかdouble positive cellが多く検出されてしまいます。Cd19単独の細胞はそこそこあるのですが、なぜか、Cd3単独はなく、Double positiveが多い状態です（フローの図を4分割すると右上に細胞があります）。

Cd3とCd19が両方positiveになるのは不可解なのですが、原因として考えられるものはありますでしょうか。

Panel builderを使った限りではleakageはほぼないです。
　

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(無題)

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No.12976-8 - 2025/05/30 (金) 18:31:21 - たく

炎症を起こす前はきっとシングルポジになるのではないですか？
おそらく炎症惹起したことにより非特異的な染色が増えたり細胞が巨大化するために自家蛍光が上乗せされてダブルポジが見えてるだけかと。

(無題)

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No.12976-7 - 2025/05/30 (金) 05:14:50 - い

>[Re:1] Canget signalさんは書きました :
> Cd3とCd19が両方positiveになるのは不可解なのですが、原因として考えられるものはありますでしょうか。

>[Re:3] うさんは書きました :
> compensationが正しくないのでしょう

私もまずはcompensationかなと思いました。マシーンのセッティングか、あるいはwashがよくされていないとか？
Cd3がBV421で、Cd19がAlexa488ですか？単独染色のサンプルも流したんですよね？

>[Re:5] Canget+signalさんは書きました :
> 大抵何かの実験上の間違いだろうと思っています。

ですよね。ただ私も何故かうまくいかなかったことが一度あり、コアの人にも聞いたのですが、「たまたま悪かっただけだから原因を考えるよりも新しいサンプルを作ったほうが早いよ」と言われたことはあります。結局原因はわからず。新しいサンプルではうまくいきました。

マーカーインクのアーティファクト

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No.12976-6 - 2025/05/30 (金) 00:38:34 - TA

>[Re:2] P2Aさんは書きました :
> 面白い報告がありますよ
> https://doi.org/10.1016/j.humimm.2017.06.233

あー、私も経験あります。
染色に使うプレートのウェルを間違えないように赤だか青だかのマーカーでウェル周りに線を入れていたら、そのウェル周辺で変な染色パターンがたまに出ることがありました。ウェル内にペン先は入れていないし、油性なら色素が溶けだすことはないと思っていたので、気付くまでに少し時間がかかりました。
今回の場合がどうかはわかりませんが、意外なところからアーティファクトがはいるものですね。

(無題)

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No.12976-5 - 2025/05/30 (金) 00:31:22 - Canget+signal

これらの論文を自分も読んだのですが、大抵何かの実験上の間違いだろうと思っています。

Fc blockが不足しているんですかねえ。

(無題)

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No.12976-4 - 2025/05/29 (木) 13:08:52 - P2A

こんなのも
https://doi.org/10.1038/s42003-023-05719-9

(無題)

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No.12976-3 - 2025/05/29 (木) 13:08:14 - う

そうなることは通常ないので、

Fcブロックが足りない（ありがち）か、compensationが正しくないのでしょう