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(無題) 削除/引用 No.12986-33 - 2025/06/10 (火) 02:49:11 - ぺんてる ありがとうございます。もしあまりにVEGFが出ないようでしたら受容体での比較も提案してみます。

(無題) 削除/引用 No.12986-32 - 2025/06/10 (火) 00:33:33 - おお >[Re:31] ぺんてるさんは書きました : > このコンディションではそもそも発現していないし多少刺激したところでそれほど増える物でもないのかなと思えてきました。報告されているwesternは？としつこく思いますが、まぁ、。。 確かにHUVECでもクリアーにWBで見れているものもあり、検出感度の差が出ているのかもしれません。 サイトカインやグロースファクターの悩ましいところは、細胞のリセプターに１分子でも結合すればシグナルは発生する可能性があるところです。またこれは細胞集団の中で一部の細胞が発現しても起こることです。なので他の細胞内にある蛋白と同じ感覚とはちょっと違うかもしれません。またこの理由からバイオセンサーのアッセイ系が使われることもあります。もっと平たく言うとリセプターをもった細胞が反応すればOKということです。

(無題) 削除/引用 No.12986-31 - 2025/06/08 (日) 00:13:47 - ぺんてる ありがとうございます。ICCやFCMも選択肢ですね。インセルアナライザは似たような機器があります、これは細胞に蛍光ラベルしないといけませんよね。BrefeldinAは知りませんでした。見てみます。 このコンディションではそもそも発現していないし多少刺激したところでそれほど増える物でもないのかなと思えてきました。報告されているwesternは？としつこく思いますが、まぁ、。。。 いっそ受容体のリン酸化のほうが比較しやすいかなと思ったり。そうなると話が変わってしまいますかね。

(無題) 削除/引用 No.12986-30 - 2025/06/07 (土) 19:25:45 - qq thermofisherのカタログをみるとbrefeldinAで分泌蛋白を細胞内に蓄積させて（westernで？）検出させるようなことが書かれていますね。

(無題) 削除/引用 No.12986-29 - 2025/06/07 (土) 15:31:30 - あの 蛍光免疫染色による定量の精度には疑問がありますが、顕微鏡で比較するよりも、 細胞を剥がしてから蛍光染色して、フローサイトメトリで比較するとかも選択枝かも。 インセルアナライザという装置もあるけど。 いずれにせよ、既に書いたように、分泌タンパクの場合には、細胞内のタンパク量は解釈が難しいです。

(無題) 削除/引用 No.12986-28 - 2025/06/07 (土) 09:37:12 - おお 細胞を染色してみてもいいかもしれませんね。qPCRで差が見られるのなら、定量性に疑問がある免疫組織染色でも目で見て強さに違いがあるようなら（もちろん同じ条件でSide by sideで観察）qPCRのデーターをサポートしていると言うことはできると思います。

(無題) 削除/引用 No.12986-27 - 2025/06/07 (土) 06:26:08 - ぺんてる > qPCRのCt値が極端に高い（=発現量が低い。ごくスタンダードなcDNA synthesisやqPCRのプロトコールを使って、Ct=32が刺激ありでCt=30になったとか）場合だと、タンパク量で差を見るのは確かに難しいかもしれないですね。 (^-^)。。。(;_;) ありがとうございます。非常に参考になります。結局報告されているtotal proteinのwesternはどうやっているんだと思い返してしまいますが、、、(-_-)少し考えます。ご経験があるかたは引き続き教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12986-26 - 2025/06/07 (土) 05:12:07 - WPB > 細胞ををコンフルにした後、交換するserum freeかGrowth Factorsのみの培地に刺激があるなしの培地にして、24時間後にそれぞれの培地を回収して比較、ですか？ まさにその通りのやり方でやった実験もあります。刺激を始めたのは回収の6時間前、とかもやったことがあります。 >おっしゃる通りです。qPCRとウエスタンをやって、qPCRで違いが出たのですがウエスタンは真っ白、でどうしようかなと思っていたところです。qPCRも違いは出たのですが、まぁ、どうなのかな？とも思っているのですが。ウエスタンが真っ白なのが気になって質問をさせていただきました。 qPCRのCt値が極端に高い（=発現量が低い。ごくスタンダードなcDNA synthesisやqPCRのプロトコールを使って、Ct=32が刺激ありでCt=30になったとか）場合だと、タンパク量で差を見るのは確かに難しいかもしれないですね。 ではなくて、RNAの量は結構あるというのであれば、WBの検出の問題になるかもしれません。既に指摘がありましたが、感度の高い検出試薬（思い切ってWest Attoみたいなの）を使ったら検出できる、とかあるかもしれません。私はWest Duraを使うことが多いですが、バンドが出ないときにWest Femtoを使うこともあります。 まあ、どちらにしろ、私だったらCell lysateは諦めてConditioned mediaでWBを試す方が先になるかな。カタログではCell lysateで綺麗にバンドを出してるから、抗体を買った会社に連絡して聞いてみるのも有りの筈ですが、抗体に関してはそれで問題が解決した試しがないので、個人的にはあまりお勧めしません。 これも既に指摘がありますが、ELISAを試すのもありだと思います（Lonzaの培養キットなんかを使っているなら、VEGF無しにするのを忘れずに）。私はたまたま他の実験との兼ね合いでMass-Specを使うという手も持ってますが、最終手段かなと思います。

(無題) 削除/引用 No.12986-25 - 2025/06/07 (土) 03:08:48 - ぺんてる >[Re:23] WPBさんは書きました : > > そもそもHUVECとか血管内皮細胞って刺激などで自分でVEGF分泌増やして血管形成も刺激させるんですかね？腫瘍とかほかからもらうほうが多そうな。 > > 私もそう思います。自分でやったことないで確証はないですが。 やはり・・・ > なにかで刺激をしてVEGFの発現が上がるのを調べてるのかと考えてました。VEGFのRT-qPCRとか試されてますか？ おっしゃる通りです。qPCRとウエスタンをやって、qPCRで違いが出たのですがウエスタンは真っ白、でどうしようかなと思っていたところです。qPCRも違いは出たのですが、まぁ、どうなのかな？とも思っているのですが。ウエスタンが真っ白なのが気になって質問をさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.12986-24 - 2025/06/07 (土) 03:00:08 - ぺんてる >[Re:21] WPBさんは書きました : > > 何か刺激を加えて、刺激あるなしで分泌量を比較したりしますか？ > > そういった実験をする場合もあります。Amiconで濃縮する場合に濃縮率を調べておくのは、発現量の比較の際にそこ（濃縮率）を計算に入れる為です。 細胞ををコンフルにした後、交換するserum freeかGrowth Factorsのみの培地に刺激があるなしの培地にして、24時間後にそれぞれの培地を回収して比較、ですか？ > > 培地を回収して、その培地とサンプルバッファーと還元剤をミックスしてヒートして、ゲルに流しています？ > > はい。その通りにやっています。昔は人に聞いたままアセトン沈殿を行ってからやっていたのですが、培地をそのまま使う（もちろんサンプルバッファと還元剤は入れて）プロトコールを見つけて試したところ綺麗にバンドが出たので、以後は培地そのままでやってます。 なるほど、ありがとうございます。参考になります。 >[Re:19] おおさんは書きました : > https://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/vegf-165a-antibody-6b7-ab69479# > > こちらHUVECでIPやってますけど、検出されてないですね、、、 > で、発現している根拠はあるのでしょうか？ 検出できるほど発現していない、ってことですかね。

(無題) 削除/引用 No.12986-23 - 2025/06/07 (土) 02:59:21 - WPB > そもそもHUVECとか血管内皮細胞って刺激などで自分でVEGF分泌増やして血管形成も刺激させるんですかね？腫瘍とかほかからもらうほうが多そうな。 私もそう思います。自分でやったことないで確証はないですが。 論文的には、刺激で（serum starvationとか、low glucoseとか）HUVECでのVEGFの発現が上がる、はあったように思います。なので、トピ主さんが刺激の話をされていたので、なにかで刺激をしてVEGFの発現が上がるのを調べてるのかと考えてました。VEGFのRT-qPCRとか試されてますか？

(無題) 削除/引用 No.12986-22 - 2025/06/07 (土) 02:45:54 - ぺんてる そもそもHUVECとか血管内皮細胞って刺激などで自分でVEGF分泌増やして血管形成も刺激させるんですかね？腫瘍とかほかからもらうほうが多そうな。

(無題) 削除/引用 No.12986-21 - 2025/06/07 (土) 02:45:02 - WPB > 何か刺激を加えて、刺激あるなしで分泌量を比較したりしますか？ そういった実験をする場合もあります。Amiconで濃縮する場合に濃縮率を調べておくのは、発現量の比較の際にそこ（濃縮率）を計算に入れる為です。 ただ、cell lysateの場合だとGAPDHとかb-Actinとかをコントロールとして「流したタンパク量は各レーン同じです」を示す形になります（個人的にはGAPDHもb-actinも量が変わらないとは限らんじゃないか、とも思うのですが）が、conditioned mediaだとそういうのが無いので困ります（これはこの掲示板でも過去にトピックになってたことあったように思います）。結局はPonceau Sで染めたメンブレンを準備したりします。 > 培地を回収して、その培地とサンプルバッファーと還元剤をミックスしてヒートして、ゲルに流しています？ はい。その通りにやっています。昔は人に聞いたままアセトン沈殿を行ってからやっていたのですが、培地をそのまま使う（もちろんサンプルバッファと還元剤は入れて）プロトコールを見つけて試したところ綺麗にバンドが出たので、以後は培地そのままでやってます。 私が研究しているタンパクの一つは多量体を作ることが知られていて、多量体の様子を調べる場合には還元剤を抜いて（Non-denaturing conditionで）サンプルバッファーだけを加えてWBする場合もあります。綺麗にDimerのサイズのところにバンドが出ます（それ以上の大きさのも出ます）。

(無題) 削除/引用 No.12986-20 - 2025/06/07 (土) 02:04:13 - ぺんてる >[Re:6] Yさんは書きました : > サイトカインやケモカイン一般に言えることですが分泌タンパク質なので細胞内に長くとどまることはないように思いますので、細胞のライゼートで検出するのは難しいように思います。またこれらのものの性質として極微量で作用するもので、培地中に分泌されたものについても濃度はせいぜい数百pg/ml以下のようです。ですので濃縮しないとwesternでは検出は難しいように思います。 >[Re:4] あのさんは書きました : > そもそも、分泌タンパクの場合、培養細胞内のタンパク量が何を意味するか、非常に解釈を悩みます。 > > すなわち細胞内のタンパク量が多いと、合成が活発なことが理由なのか、それとも分泌抑制が理由なのかは判りません。逆に細胞内のタンパク量が少ない場合も。 なるほど、確かに。。。

(無題) 削除/引用 No.12986-19 - 2025/06/07 (土) 01:57:43 - おお https://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/vegf-165a-antibody-6b7-ab69479# こちらHUVECでIPやってますけど、検出されてないですね、、、 で、発現している根拠はあるのでしょうか？ IPは効率的な濃縮としてありですが、定量性をどのように担保するのかなどが問題です。２５kDaあたりならIgGがじゃま？ あ、Lysateとかなら５０kDaあたりにもでるの？ならHUVECの上記のデーターは５０kDaのプロセッシングが途中のものかしら？このあたりもIgGのバンドがでるところですよね。 発現量を調べるならELISAのほうが良いかと思います。ただELISAも感度や使い勝手などピンキリだろうなという印象があります。 Lysateがいいか培地がいいかは目的次第だと思います。培地の場合濃縮しないと見れないなら定量性をどう担保するかが問題になってくる用に思えます。 WBの検出感度はECLのキットに大きく依存します。もしお使いのキットより高感度のものがあればそういうのを使うといいかもしれません。同時にImagerによっても感度が違います。個人的にはバイオ・ラッドのやつはそんなに感度が良くないと思っています。ただし、ビニングによって感度を上げれる用になっているImagerが大抵だと思いますので、そのへんをいじってみるといいかもしれません。高感度になるほど画像は荒くなります。あるいは近所のラボにより高感度のImagerを持ってないか探してみるのも手だと思います。また最近のECLキットは結構長い間発光しているので１時間ぐらい露光してデーターを取ることもたまにあります。 いがいとそういうところの差はでかかったりします。

(無題) 削除/引用 No.12986-18 - 2025/06/07 (土) 01:47:49 - ぺんてる 参考になります。ありがとうございます。 >[Re:17] WPBさんは書きました : > HUVECsをコンフルにした後、serum freeの培地に交換するか、あるいはGrowth Factorsのみを加えた培地（Lonzaの培養キットを使ってます）に交換して24時間後に培地を回収して、 何か刺激を加えて、刺激あるなしで分泌量を比較したりしますか？ > 24時間後に培地を回収して、それをそのままゲルに流してます。 培地を回収して、その培地とサンプルバッファーと還元剤をミックスしてヒートして、ゲルに流しています？

(無題) 削除/引用 No.12986-17 - 2025/06/07 (土) 01:15:26 - WPB >[Re:15] ぺんてるさんは書きました : > 細胞溶解ではなく培地のほうがいいのでしょうか？ちなみに培地ってウエスタンに流しますか？ELISAでやるイメージがありますが 扱っているタンパクはトピ主さんと違いますが、同じく内皮細胞からの分泌タンパクを研究しているものです。培地（Conditioned media）でWBやりますよ。ELISAでもやりますが、ELISAは高くつくので……。 勿論発現量の違いにもよると思いますが、私の扱ってる分泌タンパクだとConditioned mediaでも十分に検出可能です。HUVECsをコンフルにした後、serum freeの培地に交換するか、あるいはGrowth Factorsのみを加えた培地（Lonzaの培養キットを使ってます）に交換して24時間後に培地を回収して、それをそのままゲルに流してます。6穴プレートで培地を2ml使ってます。 HUVECsはserum free starvationに弱いので、そこは勘案しておく必要があります。これが理由でGrowth Factorsのみの培地で実験するようになりました。 Growth Factorsのみの培地を使う場合、トピ主さんの場合にはVEGF含まれてたらそれを抜く必要があるかも。 発現量が低いのが心配な場合には、培地量を減らしたり（でもこれはあまりお勧めしない。培地交換の前後で培地量を変えるとそこを懸念する人もいるから）、回収後にAmicon等で濃縮したり（念の為、Amiconにかける前後で重さを測って濃縮率も調べておく）してます。 私の研究対象タンパクも、各会社のカタログではwhole cell lysateでWBをしていて非常に綺麗なバンドが出てますが、自分で同じことをやってもあんな綺麗なバンド出たこと無いです。自分の研究対象タンパクのsignal peptideを抜いた発現ベクターを作ってHEK293に発現させてcell lysateとconditioned mediaでWBをしたら、この場合はcell lysateでのみ綺麗なバンドが検出されました。まあ、HUVECsとHEK293で条件も違うから一概に決めつけられませんが……。

(無題) 削除/引用 No.12986-16 - 2025/06/06 (金) 23:29:14 - ぺんてる >[Re:15] ぺんてるさんは書きました : > 細胞溶解ではなく培地のほうがいいのでしょうか？ >[Re:13] totoさんは書きました : > 量の少ない蛋白のバンドをみるにはIP-Westernが一番です。培地を大量にあつめるか、抽出液かで。一般的に分泌蛋白は定常状態で細胞内に相当量存在するので、抽出液のほうが成功率は高そうですが、両方やった方がいいです。 両方ということですね、失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.12986-15 - 2025/06/06 (金) 23:09:14 - ぺんてる 細胞溶解ではなく培地のほうがいいのでしょうか？ちなみに培地ってウエスタンに流しますか？ELISAでやるイメージがありますが

(無題) 削除/引用 No.12986-14 - 2025/06/06 (金) 23:00:40 - ぺんてる マテメソは普通にウエスタンの方法で、使用した抗体はこれとこれとこれ、というふうに書いてあってその抗体の一つがVEGF抗体ということです。著者に問い合わせもできますけどあまり教えてくれないですし、抗体の会社に問い合わせても一般的なウエスタンのトラブルシュートばかりですのでここで経験者がいれば話を聞けるかなと思いました。 大量抽出、ELISA、IPは試してみようかなと思いますが、やっかいなターゲットなのでしょうか。ウエスタン、気になる。。。

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