全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12988-14 - 2025/06/14 (土) 01:15:43 - おお スペシフィックプライマーで、PCRようにタグのついてないプライマーを使い酵素をKOD FXにしたということですね。良かったです。

(無題) 削除/引用 No.12988-13 - 2025/06/13 (金) 18:54:17 - おおさか おおさん、G25さん たくさんのご意見をいただき本当にありがとうございました。 酵素サイトのついていないプライマー＆KOD FXを試したところうまくいきました！ 今後ともお力添えいただけたらと思います。 ありがとうございました！！

(無題) 削除/引用 No.12988-12 - 2025/06/12 (木) 01:58:07 - おお もしかしてRIラベルしてスメアが見られるかという話なのかもしれませんね。昔はRTの効率を確かめるためにやることがあったようです。たとえば１ug Total RNAをRTして１００ng流したら、じっさいmRNAは１０ngより少ないと思われます。PolyAでRTしても１０ngがレーン全体に分散していれば見れる見込みがありません。ランダムオリゴのばあいリボソームなどもcDNAになるのでいくらかスメアが見えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12988-11 - 2025/06/11 (水) 10:30:04 - おおさか おおさん ＞それに目的のcDNAができていたとしても、ngにも満たないでしょうから蛍光色素では到底検出できませんよ。 以前何かで調べた際にスメアが見えればOKと読んだので、スメアが見えない＝失敗かと考えていました…。 大変勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12988-10 - 2025/06/10 (火) 17:19:24 - おお cDNAを電気泳動してもあまり有用な情報は得られないと思いますが。cDNAで小さい分子量とか見えたならそれはTotalRNAに含まれるtRNAとかsnRNA、マイクロRNAなどではないかと。 それに目的のcDNAができていたとしても、ngにも満たないでしょうから蛍光色素では到底検出できませんよ。

(無題) 削除/引用 No.12988-9 - 2025/06/10 (火) 16:14:25 - おおさか おおさん、G25さん たくさんのアドバイスをいただきありがとうございます。 本日取り急ぎ研究室にあるもう一つの逆転写酵素であるAMVを用いてやり直してみました。プライマーはオリゴプライマーもランダムもどちらも在庫を切らしていたため、GeneSpeを使用しました。 合成後、電気泳動で確認を行ったのですが、ダイマーのようなものだけが下部に見えました。これは成功しているのでしょうか？ nestedは存じております。試したことはないので、今後やってみようと思います。ありがとうございます。 またタッチダウンは、high capaを用いたｃDNA合成後に行っていますが、失敗でした。 逆転写酵素変更後再度試してみようと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12988-8 - 2025/06/10 (火) 00:47:38 - おお G25さんもところどころで触れてますがNested PCRはご存知ですか？ また条件を探るてまを省き、意外と特異的な増幅が期待できるタッチダウンPCRというのも使ってみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12988-7 - 2025/06/09 (月) 15:46:24 - おお >[Re:4] おおさかさんは書きました : > おおさん > ＞十分な発現量が担保されているサンプルを使ってますか？ > こちらは問題ないと思います。 > > ＞GoTaqだとエラー頻度も気になりませんか？ > 以前まではExTaqを用いていたのですが、一度に取れる増幅量が少なく、エラー頻度が上がることを前提に増幅量の多いGoTaqを選択しています…。 私の場合はPCR産物をプラスミドに入れるとか言う作業がほとんどで、実際に使う量は電気泳動でかろうじてでも見れれば良いくらいの量で事足りましたので、量はあまり気にしなかったですけどね｡ 最近の長いDNAでも対応できる正確性が高い酵素は増幅効率も非常にいいので試されてはどうでしょうか？ Phusion DNA Polymerase PrimeSTAR DNA Polymerase Q5 High-Fidelity DNA Polymerase など > > ＞あるいはSpecific primerをつかってRTするほうがPCRがかかりやすくなることが多いです。 > 勉強不足で大変お恥ずかしいのですが、specifiを使えることを知りませんでした…調べてみたのですが、Reverse側のみを使用するのでしょうか？ Reverse側のみです。PCRに使うプライマーでも良いし、それよりも外側に設定しても良いです。私なら外側に設定してそのプライマーとPCRに使うプライマーを混ぜてRTするかも知れません。配列によってRTかかりにくいとかあったら嫌だなと思うので。

(無題) 削除/引用 No.12988-6 - 2025/06/09 (月) 15:36:36 - G25 High Capacityはrealtime qPCRなどのため短フラグメントで定量性良く逆転写する設計ですからクローニングには不向きですね。 クローニングにはGOTaqも不向きですが今どきExTaqも使わないでしょうね。 ExTaqもストレートなTaqよりマシとはいえエラー率は低くない。 今ならToyoboのKOD (FX neoやONE)とか使ったことないけどTakaraのPrime STAR, Ex Premierにたいなアーキア由来のα型ポリメラーゼを使うのが普通だと思います。正確性も伸長性・増幅力も段違い。 無料試供品を貰えるはずなので、それだけで一仕事できちゃう。 逆転写をgene-specific primer (GSP)でやるのなら普通はPCRのrevers primerとは別の、それより下流のプライマーを使うのが一般的です。 GSPとrevers primerを共通にしても出来ないことはないだろうけど。 一つのメリットはGSPに対してrevers primerがnestedになるので、非特異的プライミングを低減できる。

(無題) 削除/引用 No.12988-5 - 2025/06/09 (月) 09:55:12 - おおさか G25さん ＞逆転写の系についての情報がないですね。 どのRTase システム？ 失礼いたしました。キットはHigh Capacityを使用しており、プライマーはランダムプライマーです。 ＞randomプライマーの場合、投入濃度にもよるけどcDNAは平均長数百ntくらいに断片化します。 研究室にあるものをまず使えという指令によりランダムを使っております。 指導教員にプライマーの変更を提案してみます。ありがとうございます。 ＞まずは普通のプライマーで標的を増幅して、それができたらそれをテンプレートにして制限酵素配列付加するためのPCRをしたら良いです。 試してみます

(無題) 削除/引用 No.12988-4 - 2025/06/09 (月) 09:52:02 - おおさか おおさん ＞十分な発現量が担保されているサンプルを使ってますか？ こちらは問題ないと思います。 ＞GoTaqだとエラー頻度も気になりませんか？ 以前まではExTaqを用いていたのですが、一度に取れる増幅量が少なく、エラー頻度が上がることを前提に増幅量の多いGoTaqを選択しています…。 ＞あるいはSpecific primerをつかってRTするほうがPCRがかかりやすくなることが多いです。 勉強不足で大変お恥ずかしいのですが、specifiを使えることを知りませんでした…調べてみたのですが、Reverse側のみを使用するのでしょうか？ 自作のプライマーがSpecificにあたるのですが、それを使えるということでしょうか？本実験で目的としている配列は既に全長が分かっているため、自作プライマーは、Reverse側は終始コドンから５’側に向かって25bpほど伸ばしたものに制限酵素サイトを付けています。

(無題) 削除/引用 No.12988-3 - 2025/06/07 (土) 09:27:26 - G25 逆転写の系についての情報がないですね。 どのRTase システム？ プライマーはoligo-dT, Random あるいはgene-specific? randomプライマーの場合、投入濃度にもよるけどcDNAは平均長数百ntくらいに断片化します。完全長のcDNAを一本釣りするのには向きません。 GoTaq有り無し判定でスクリーニングしたりする分には安価でよろしいですが、 クローニングには適しているとは言えません。 もっとエラー率が低く伸長性や増幅能力の高い酵素を選ぶべき。 制限酵素認識配列を付加したプライマーでのPCRは難度が高くなります。 まずは普通のプライマーで標的を増幅して、それができたらそれをテンプレートにして制限酵素配列付加するためのPCRをしたら良いです。

(無題) 削除/引用 No.12988-2 - 2025/06/07 (土) 02:18:53 - おお 十分な発現量が担保されているサンプルを使ってますか？1800bpが特段長いという印象はないですが長くなるほどかかりにくくなるのは事実です。じっさい１００bぐらいのだと結構楽ですから。LongPCRとまでいえるほどの長さではありませんが、LongPCRに対応してるPfu系のPCRエンザイムのほうがいいのかもしれません（どれかよくわからない場合は聞いて下さい）。GoTaqだとエラー頻度も気になりませんか？ cDNA合成にランダムプライマーを使っているようでしたらPolyAに変更してください。あるいはSpecific primerをつかってRTするほうがPCRがかかりやすくなることが多いです。Total RNAから更にmRNAをエンリッチさせると更にかかりやすくなります。 よくわからないですが最近はもっぱらqPCRのためにRTを最適化しているかもしれません。それならば長さはあまり重要視されてないかもという危惧はあります昔からあるSuperScriptなどのほうがいいのかもしれません。 その他のコツとしてはcDNAはRNaseH処理をしてから使うということです。これでかなり変わることがあります。またプライマーはNested PCRができるように外側にもうひとペアー作っておくと感度、特異性が上がることが多いです。 単純でワークする可能性が高い方法は９００bpぐらいに分けてPCRして３ピースでつなぐとか、Overlap PCRで全長を改めて作るとか。

cDNA→インサート配列 削除/引用 No.12988-1 - 2025/06/06 (金) 17:07:35 - おおさか いつも勉強させていただいております。 臓器からtotal RNA→cDNA→インサート配列の切り出しを行いたいと考えています。 一度成功したことのあるプロトコルにて、目的配列を変更し再度行おうとしているのですが、いっこうに配列を得られず悩んでいます。 目的のインサート配列が約1800bpあるのですが、これが長すぎてうまくいっていないということはありますでしょうか…？ 以前成功した際は約700bpのものを対象にしていました。 cDNAは電気泳動にてスメアを確認しています。（バチバチに光ります） インサート配列の切り出しには研究室にあるGoTaqを使用し、プライマーは自作で制限酵素サイトつきの30bpほどの物です。 アニーリング温度、cDNAの希釈、プライマー添加量の変更は試しましがダメでした。どなたか同じようなご経験のある方がいましたらアドバイスいただきたいです。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---