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(無題) 削除/引用 No.13021-7 - 2025/07/07 (月) 09:56:34 - ウェスタン初心者 皆様ご意見ありがとうございました。 高分子量のものはオーバーナイトくらいしないと残るもののようですね。 ウェスタンの結果を見て高分子量のタンパク質のバンドが薄いようなら調整したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.13021-6 - 2025/07/05 (土) 07:04:44 - おお 昔はセミドライで９０分を目安にトランスファーしてました。均一のゲルで上から３分の１はトランスファーで残る感じで、みたいものをそれより下に来るようになるべくゲル濃度を調節したりしていました。グラジエントならある程度解決すると思います。 Wetのシステムでも同様にしてましたが、ある日オーバーナイト（２０Vぐらいで）でトランスファーすると高分子もほぼ膜に転写されていたのでしばらくはそれでやっていました。小さい分子は物によってはそれでいくらかすり抜ける傾向が見られたのでそれからはPVDFを使うようにしてました。 いまはXCell Blot Module をつかっていて、そのマニュアルをむしして９０分でトランスファーしてますが全体的にちゃんとトランスファーされているようです。

(無題) 削除/引用 No.13021-5 - 2025/07/04 (金) 16:38:04 - TS グラジエントゲルやアクリルアミド濃度が低いゲルを使っても、すべては無理ですね。例えば、SDSを0.1％くらいまで上げても、200kDaくらいから上はCBBで見えるレベルのタンパクは残るし、ご自身が見たいタンパク質の分子量付近が十分に移っていればいいんじゃないですかね。個人的には、転写効率よりも、転写ムラのなさのほうが定量には重要かなと思っています。 同じサンプルを一斉に流して、何かのタンパクが同じように検出されるかとかを確認するのもよいかもしれません。 ＞50kDa以上のバンドがはっきりと出ました。 これはゲルの濃度にもよると思いますが、高めだと残るんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.13021-4 - 2025/07/04 (金) 12:17:54 - hjk 高分子量領域は転写に時間かかります.特に 100KDaを超えるようなものですと効率よくその大部分を転写することはどのような装置を使っても事実上困難です（転写すること自体は200KDa<のタンパク質でも可能ですが、膜に移行するのは量としてはゲルの中の200KDa<タンパク質の1/3以下くらいで量です）。なんでもそうですが万能な実験技術はないので、方法上の限界を知った上で、その範囲内で結果の解釈を行うことになります。

(無題) 削除/引用 No.13021-3 - 2025/07/04 (金) 11:47:42 - 774R 移動度が遅いからゲルの上の方にバンドになるわけで、泳動の時に移動度が10倍違うタンパク質なら転写の移動度も10倍違ってきます。 WBで見たいタンパク質が転写されていれば問題ないと考えます。

(無題) 削除/引用 No.13021-2 - 2025/07/04 (金) 11:28:43 - う 高分子量側は残りますよ。時間を延ばしたりバッファーを変えても減りますけど残ります。 できるだけ移動させたいなら、低い電圧でオーバーナイトでやれば減ります。 ゲルの横方向（同じ分子量方向）の転写率は同じ、という前提で増減を比較しますけど、ゲルの縦に比較したい時（ペプチド切断とか、分子修飾とか）は、サブマリンで低電圧でゆっくり長く流すことをお勧めします。 あと、タンパクはメンブレンを結構通り抜けていまして、全部くっついているわけではないので、そこも注意が必要かもしれません。 ゲルを縦に比較しないのであれば、残っててもいいと思いますよ。

転写の最適化についての相談 削除/引用 No.13021-1 - 2025/07/04 (金) 10:41:54 - ウェスタン初心者 Invitrogenのmini gel tankを使ってSDS-PAGE後のゲルからPVDF膜に転写しています。 転写確認のため、転写後のゲルをCBBで染色すると50kDa以上のバンドがはっきりと出ました。 転写時間を増やしても、転写バッファーに0.01%SDSを加えても結果に変化がありません。 調べた感じでは全てゲルからメンブレンに転写されるのが理想と書かれていたのですが、実際なくなるものでしょうか。 この状態で抗体反応に進んで定量性はあるのでしょうか？

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