Whole cell lysateのWBならば 普通のレムリーbuffer (=SDS sample buffer)（ただし還元剤とBPBはまだ入れない）で直接細胞を溶解すれば良いのではないでしょうか。(超音波の可溶化条件至適化等の苦労をしなくて済みますし、ほとんどのタンパク質をほぼ確実に可溶化できます。SDSの強力な変性作用で多くの酵素は失活しますので、操作中のタンパク質の分解や脱修飾のリスクはかなり抑えられます)クロマチンが解体するので遊離したDNAで高い粘性を帯びますが、超音波をできれば氷中で10秒x3~4回やれば粘性はほぼなくなります（粘性なくなったら止める、それ以上はしないというか、溶解の時点でタンパク質のほとんど全ては可溶化しており、タンパク質抽出という点ではそれ以上超音波しても意味がないので。）〜17℃くらいの温度で遠心して不溶物（多分ほとんどないとおもう）を除去し、上清を回収しwhole cell. protein試料とします。
タンパク質定量は試料の一部をとって適宜希釈（水で10分の１くらいに希釈）してからBCA法で行なってください。SDSを含むのでブラッドフォールド（CBBG250使いやつ）では測定できません。
タンパク質定量が終わったら還元剤とBPBを必要量加えて、加熱処理（ただし膜タンパク質など難溶性タンパク質を調べる目的の場合は加熱処理あり、と無しで一度予備検討したほうがいいです。加熱によりSDS不溶性の凝集を起こして高分子量化したりゲルに入らなくなるものが時々あるので。）して電気泳動します。 |
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