生成Aiによると次です
@ FSC vs SSC ゲート：細胞の大きさと内部構造による粗い選別
•通常の浮遊性細胞では、健常な細胞は右下〜中央あたりに集団を形成します。
•死細胞やデブリ（破壊された細胞片）はFSC/SSCが小さく、左下〜左上に現れる傾向があります。
•最初のゲート（P1など）では、生細胞と思われる領域をやや広めにカバーしておくのが一般的です。
•壊死細胞を除外しすぎると、PI陽性細胞の一部が欠落するおそれがあります。
•FSC-Hの広がりやSSCのばらつきを見て、異常に小さいイベント（デブリ）を除外する。
A シングレットゲーティング（FSC-A vs FSC-Hまたは SSC-A vs SSC-W）
•二重細胞や凝集体を除くために、FSC-A vs FSC-Hプロットでシングレットを抽出します。
•通常のアポトーシス解析では、FSC-AとFSC-Hが比例する（45度線上に並ぶ）イベントがシングレットです。
•「P2」などの名前をつけて次段階へ進みます。
B ライブ/デッドの染色前後の考慮
•Annexin V/PI解析に移る前に、背景自動蛍光が多い細胞や非特異的染色の領域は注意が必要です。
•PIやAnnexin Vは、膜透過性の違いやリン脂質の露出に依存して染色されるため、デブリや断片を含めると偽陽性が出やすくなります。
象限 Annexin V PI 状態
Q1（左上）− + 一部の壊死細胞（膜破壊済）
Q2（右上）+ + 後期アポトーシス/二次壊死
Q3（右下）+ − 初期アポトーシス
Q4（左下）− − 生細胞（正常）
ポイントと注意点】
1.浮遊性細胞では機械的ストレスや洗浄で容易に壊死するため、早めの解析と丁寧な操作が重要。
2.ゲーティングを厳しくしすぎると、アポトーシスや壊死細胞を除いてしまうことがあります。目的に応じて多少緩める選択も検討してください。
3.Annexin VはCa²⁺依存性なので、バッファーにCa²⁺が含まれていることを確認してください。
4.PIは核染色であるため、RNAや細胞残骸に非特異的に結合することがあります。DNase処理や透過性コントロールがあると精度が上がります。
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【結論・推奨プロトコル要約】
1.FSC/SSCで生細胞と思われる母集団を広めに取る（P1）
2.FSC-H vs FSC-Aでシングレット選別（P2）
3.PI/Annexin V染色で4象限解析（Q1〜Q4）
4.デブリが多いときは、FSC低領域をさらに別途「デブリ」として定義し、除外or参考として残すことも一つの手段です。 |
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