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(無題) 削除/引用 No.13057-7 - 2025/08/05 (火) 12:13:46 - AA あるタンパク質のどのドメインが機能上重要で欠失によって機能喪失につながるのか、をプラスミド上の操作において作業前に逡巡する利用がいまいちわかりません。 発現プラスミド導入のネガティブ対照にしたいなら空ベクターやGFPとか無活性の分子をいれたもので良いし、機能上大切なドメインを知ること自体が目的なら、怪しそうなパターンをいくつも作って実際に調べれば良い。といいますか、ORFのクローニングってそういう目的で行われるのではないでしょうか？ (患者型変異が実際にはどういう変化をもたらしているのか知る、など) 質問者さんの場合、 ・データベース上で明らかになっているドメインをしらべてそれぞれ欠失したバージョン ・欠失長がいろんな長さで違うバージョン など、色々作って試すことが必要で、予測だけで1パターンを作ることはよくないんじゃないかと思います floxマウスを作るときなども、どのexonを狙うべきか決めきれないときはそれぞれのexonを抜いたバージョンのORFをいくつか作って活性を調べたりします。

(無題) 削除/引用 No.13057-6 - 2025/08/05 (火) 02:09:47 - おお >[Re:5] ぬるさんは書きました : > お二人ともありがとうございます。 。 > おおさんのおっしゃるとおり、直接関与するアミノ酸がなければいいのではないのかと今は思っているのですが、その場合にまずはどこを欠失させるのが方法として正しいのかを調べる方法が知りたいです。 例えばキナーゼとか酵素活性がわかっていて、同類キナーゼに保存されているアミノ酸で活性に関与していることがわかっているものを潰すとか言うのがたいてい取られる方法論だと思います。ある程度明確な活性に関するデーターが同様の活性をもつ蛋白の研究でわかってなければ絞りようがありません。 また、正しいという概念は捨ててください（単なる言葉の用言の仕方でそこまで言うことでもないと思いますが）。すべてのことが予期できると思わない方が良いです。 でそれができなさそうであれば、その領域のアミノ酸で相同性の高いアミノ酸配列をサーチしてください。BLASTとかがいいです。検索で引っかかったアミノ酸配列が何かの知られてたモチーフと言えるなら、そのモチーフの部分を欠失させるという方法はです。基本的に相同性が高い蛋白が何らかの特徴を共有していれば、その配列はその特徴に重要な配列という推測ができます。ですからその相同性が高い配列を除くようにするのがよくやる方法です。昔は抽出されたモチーフは少なかったので、配列の相同性を調べてモチーフとされていなくても上記のような方法で相同性に意味が見いだせるなら、その配列を欠失させたりして実験を進めていたと思います。いまは蛋白間で類似の配列があった場合モチーフとしてすでに抽出されていることが大抵だと思います。

(無題) 削除/引用 No.13057-5 - 2025/08/04 (月) 19:53:24 - ぬる お二人ともありがとうございます。 さすがにある遺伝子としか言えないのですが、「欠失させたときに機能が失われる領域」というのがいまいち理解できていません。 アミノ酸に翻訳される領域のうち、少しでも欠失させれば機能が失われるのか、ある程度のところまで欠失させないといけないのかの判断ができません。 おおさんのおっしゃるとおり、直接関与するアミノ酸がなければいいのではないのかと今は思っているのですが、その場合にまずはどこを欠失させるのが方法として正しいのかを調べる方法が知りたいです。 皆さんはどの様に調べているのでしょうか？ よろしくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.13057-4 - 2025/08/02 (土) 03:34:54 - おお 膜タンパクなら更に考慮することが増えますね。

(無題) 削除/引用 No.13057-3 - 2025/08/02 (土) 03:33:02 - おお ケースバイケースですのでタンパク質やその狙いにを考慮したうえで判断することになると思います。 例えば活性を直接担う蛋白であればその活性に直接関与するアミノ酸がなければいいわけです。なので１アミノ酸で十分ですし、何ならそのアミノ酸を置換するだけという方法もよく取られます（そちらのほうが多い）。似たケースでリン酸化で活性化されるならそのリン酸化部位だけを置換するとか。 ついでにいうとたとえばプロテアーゼでそのターゲットを知りたいとき、活性に直接携わるアミノ酸（セリンプロテアーゼならセリン）を置換してターゲットに結合しても分解されないようにすることで、効率よくInteractionが検出できるとか。 次にありがちなのは機能的、構造的ドメインを欠失させることです。構造が大体わかっているならその構造単位であるドメインを欠失したものを作る。デメリットはそのドメインの欠失で全体の構造の歪が起きる可能性だと思いますが、そういう細かいことは予測がつかないことも多いのでやってみるしかない。構造的ドメイン間のループ（ドメインを繋ぎ止めている配列）の場合、その長さも考慮するべきかもしれません。 アミノ酸配列からその活性に関わっているだろう特徴的な部分を欠失させる。あるモチーフや特徴的配列が活性に関わっているということがある程度明らかな場合または予測している場合、その部分を欠失させる方法です。あるアミノ酸組成が偏っているとかリピートしている配列があるとか、そのアミノ酸配列に相同性のある配列ががいろいろな他の蛋白で見られるとか。 他にも考えられるべきパラメーターはあるかもしれませんが、たいてい設計するときにそういうことを色々考えて決めていると思います。それでもベストなものを決めかねるなら類似した蛋白で機能を欠失させたものを作ってないかとか探してみるのも手ですし、複数のコンストラクトを作って試すというのもありです（色んな意味でこちらのほうが良さそうです）。

(無題) 削除/引用 No.13057-2 - 2025/08/01 (金) 16:30:18 - 774R 理論上、どのような遺伝子のどのような機能を欠損させて医のですか？理論上は？

インバースPCRで使うプライマーの作り方 削除/引用 No.13057-1 - 2025/08/01 (金) 15:03:46 - ぬる いつも勉強させていただいています。 生物学系の学生です。 インバースPCRで、ある遺伝子の機能を欠損させた状態のプラスミドを作ることになりました。 このときに、片方のプライマーを欠失させたい領域の外側に設計するのまでは理解できます。 でも、どこまで欠失させるのがベストなのかが理論的に分かりません。 どういう風に設計するのが理論上正しいのでしょうか？ 考え方をご教授いただけると嬉しいです。 よろしくおねがいします。

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