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LR Clonase　LR反応がうまくいかない 削除/引用 No.13073-1 - 2025/08/14 (木) 16:43:35 - 大学 Gatewayシステムを用いてプラスミドを構築しようとしています。 Entry vectorにはpENTR/D-TOPO vectorを用いて目的の配列を組み込みました。 その後、TOP10を用いて形質転換したところコロニーが現れ、M13プライマーでPCRしたところ、目的のサイズにバンドが現れました。 コロニーからWizard Plus SV Minipreps DNAを用いてプラスミドを抽出し、Destination vectorとLR反応しました。 LR反応は、メーカーのプロトコル通りに行いました。Entry vector（150ng/μl) 1μl＋ Destination vector（150ng/μl) 1μl + TE Buffer(pH=8.0) 6μlを加えた後、LR Clonase™ II酵素ミックスを2μl加えました。25℃で12時間ほどインキュベーションし、Proteinase Kを1μl加えたものを形質転換に使用しました。 その後、TOP10を用いて形質転換したのですが、コロニーが１つも現れません。 DH5αなどでも行ったのですが、全く現れません。 コンピテントセルは普段10μlで、LR反応物は1μlで行っています。 原因がわかる方、ご享受いただけますと幸いです。

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