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トピック作成者です 削除/引用 No.13091-11 - 2025/09/02 (火) 23:19:43 - k >noname様 情報をありがとうございます。 プラスミド3種類でも、それなりの数のコロニーが出てくるのですね。 これまでのコメントも踏まえますと、どうやら大腸菌では複数プラスミドの同時導入が上手くいく場合がかなりあるように思えます。 さて、こちらで実施いたしました実験の結果をお伝えいたします。 結論としては、プラスミド2種類の同時導入はコロニーが出てきませんでした。 都合により実験の詳細はお伝え出来ず恐縮ですが、プラスミド導入量など条件は何パターンか試したものの、すべてダメでした。 もっとも、プラスミドAとBはかなり大きいプラスミドでして、その辺りが導入されにくさと関係があるのかもしれません。 もう少し条件を検討したいと思いますが、�Aの方法(段階的にプラスミドを導入する)メインで目的の菌株の取得を目指したいと思います。 最後になりますが、色々とご教示下さいました皆様に感謝申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.13091-10 - 2025/09/01 (月) 09:03:55 - noname 変換がおかしくなってました。1プレートあたり10の200乗ではなくて、10個から200個です。

(無題) 削除/引用 No.13091-9 - 2025/09/01 (月) 09:00:50 - noname 私は３つのプラスミドを自作のケミカルコンピでやっていますが、回復培養をきちんとすれば、各100ngのプラスミドを突っ込んで、10^200コロニーはでてきますよ。

トピック作成者です 削除/引用 No.13091-8 - 2025/08/31 (日) 00:03:36 - k 皆様、コメントを誠にありがとうございます。 >おお様 「Sm耐性コンピテントセル用大腸菌」を初めて知りました。であれば仰る通り、Smを加えてコンピを作製するプロトコルも存在してそうですね。 すみません、微生物名に関してはぼかさせていただきますが、プラスミドAとBのOriは異なっており、また共存可能なことが論文において示されております。 >774R様 承知いたしました。�@の結果は本トピックにて報告いたします。 >大腸菌様 私の確認が不足しており、当該報告を見落としておりました。教えていただき感謝申し上げます。 複数プラスミドが取り込まれる確率の高さに驚きました。報告者の方とは条件が色々と異なっているのでしょうが、�@の方法で上手くいくことに期待してみます。

(無題) 削除/引用 No.13091-7 - 2025/08/30 (土) 16:23:55 - 大腸菌 エレクトロポレーションではなくケミカルコンピですが、実際に実験された方の報告が以前ありました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3040 それによると、AmpRとKanRのプラスミドを混ぜて形質転換して当量をまき出したときのコロニー数は、 Amp plate 276 Kan plate 220 Amp+Kan plate 153 とのことでした。つまり、かなりの割合で複数のプラスミドが取り込まれているということになります。

(無題) 削除/引用 No.13091-6 - 2025/08/30 (土) 12:44:49 - 774R 哺乳類細胞などへのトランスフェクションであれば、プラスミドとTF試薬の複合体として細胞に取り込まれるので、かなりの高確率で共発現になるけども、大腸菌のトランスフォーメーションでは、たまたま細胞壁に付着したものが取り込まれる格好で、その確率は非常に低い（菌体数の数で出現コロニー数を稼いでる）。 プラスミドも複合体を形成しないので、大抵の場合１つしか入らないイメージを持っています。 もし�@の方法でうまくいったら教えて欲しいです。

(無題) 削除/引用 No.13091-5 - 2025/08/30 (土) 08:41:48 - おお >�Aの方法でプラスミドAを有するコンピテントセル'作製時、培地(18℃でOD0.5〜0.8まで培養予定)に抗生物質を添加してよいものか、 大腸菌だとストレプトマイシン耐性のコンピテントセル用大腸菌があって、ストレプトマイシンを加えてコンピテントを作ることはあることだと思いますけどね。 イーストとかで２つ同時にというのもあった気がするけど。 微生物とか漠然とした話なので答えておいて質問で考えているケースで当てはまるか不安ではありますが。枯草菌とかそういったものなんでしょうか、、、 あと生物によっては同じOriのプラスミドを共存させることが難しい場合もありますので、どうなのかなぁ、、、と。

ご意見ありがとうございました。 削除/引用 No.13091-4 - 2025/08/29 (金) 23:59:48 - k トピック作成者です。 774R様、大腸菌様、大変参考になるコメントをありがとうございました。 2つのプラスミドが導入されるメカニズム・考え方に関しまして、お二人のご意見はどちらも一理あるように私には思えました。微生物の種類やコンピの良し悪し、プラスミドの大きさや導入量など、様々な要素が絡んでくることなのかもしれません。 とりあえず準備が整いましたので、上手くいくことを期待して�@の方法を試しつつ、�Aの方法(まずは抗生物質無添加で行ってみます)でもじっくり進めてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.13091-3 - 2025/08/29 (金) 07:59:27 - 大腸菌 エレクトロポレーションでプラスミドが菌に入るときって、1分子が独立に入るというより、ある容量に含まれる溶質が一度に入るんじゃないでしょうか。ですから、�@の方法でそれほど効率が落ちることはなさそうに思えます（印象論）。 また、コンピテントセルの効率が十分に高ければ、2つのプラスミドを同時に形質転換することもできると思います。少なくとも大腸菌ではできます。

(無題) 削除/引用 No.13091-2 - 2025/08/28 (木) 19:35:14 - 774R �@の方法は、考えれば分かることだけど難しいと思われます。高効率コンピでコロニーが沢山出ると効率が高いと錯覚するが、実は元の菌体数は桁違いに多く、導入確率で考えるとめちゃくちゃ低い。2つが同時に入る確率はその2乗で低くなり絶望的。 �Aのほうが確実。抗生物質を入れなくてもプラスミドはそう簡単に落ちないので、入れる必要はない。恐らく入れても問題は起きないとは思う。 もし�@でも上手くいくのではと期待するのであれば、�@と�Aを同時進行でやるとよいでしょう。

微生物にプラスミドを2種類導入する方法 削除/引用 No.13091-1 - 2025/08/28 (木) 17:12:16 - k お世話になります。 ある微生物にエレクトロポレーションで、プラスミドAとBの2種類を導入することを考えております(AとBは共存可能です)。 手順としては、以下の2種類の方法があるかと思います。 �@コンピテントセルを作製する→プラスミドAとBの溶液を混合し、一度のエレクトロポレーションで同時に導入する �Aコンピテントセルを作製する→プラスミドAを導入する→プラスミドA保有株由来のコンピテントセル'を作製する→コンピテントセル'にプラスミドBを導入する �@の方法は成功すれば実験が速く進みそうですが、目的の菌株を取得できる確率は低いように思えます。�Aの方法は時間がかかりそうですが、実験を着実に進められそうです。他にどのようなメリット・デメリットがございますでしょうか。何か知見をお持ちの方のご意見をいただけますと幸いです。 なお、�Aの方法でプラスミドAを有するコンピテントセル'作製時、培地(18℃でOD0.5〜0.8まで培養予定)に抗生物質を添加してよいものか、研究室内で意見が分かれております。この点もコメントいただけますと大変ありがたく存じます。 厚かましいお願いですが、何卒よろしくお願いいたします。

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