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(無題) 削除/引用 No.13093-11 - 2025/08/29 (金) 17:52:45 - 大学院生 > 収量の情報って濃度だけじゃ役に立たないんだよね。 > スターティングマテリアルの量がどれくらいで、精製物の体積がどれくらいで、という情報があって初めて濃度の情報が生きてくる。あるいは濃度の情報無しで、精製物の物質量だけでもいい。濃度なんて溶媒の体積を変えればどうにでもなるんだから。 やはりそうですよね。 自分も勉強不足な所があるため、その辺りの知識をより学んでいきたいと思います。 本当に丁寧かつ親切な御解答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.13093-10 - 2025/08/29 (金) 13:52:35 - G25 >>[Re:7] nonameさんは書きました : >> 0.1って単位は何ですかね？A260の値？ >すいません、記載漏れてました。濃度（μg/μL）です。 収量の情報って濃度だけじゃ役に立たないんだよね。 スターティングマテリアルの量がどれくらいで、精製物の体積がどれくらいで、という情報があって初めて濃度の情報が生きてくる。あるいは濃度の情報無しで、精製物の物質量だけでもいい。濃度なんて溶媒の体積を変えればどうにでもなるんだから。

(無題) 削除/引用 No.13093-9 - 2025/08/29 (金) 10:39:08 - 大学院生 >[Re:6] G25さんは書きました : > ノートや手元の資料をざっと見てみましたが、 > > 私が参考にした方法では、top agarを使って混釈培養してtop agarごと回収、cheese clothで濾してプラスミド精製に行くとか、Molecular Cloningだとコロニーを回収しTBなどrich. mediumで定常期まで液体培養したものを使うとか、プロトコールにマイナーなバリエーションがありますが、あまり特別なことはなくて、基本通常のプラスミド精製を踏襲すればいいです。 > ラボの兼ね合いも含めて、さまざま検討したいと思います。 丁寧な回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.13093-8 - 2025/08/29 (金) 10:38:01 - 大学院生 >[Re:7] nonameさんは書きました : > 0.1って単位は何ですかね？A260の値？ すいません、記載漏れてました。濃度（μg/μL）です。 A260/A280は、2から4程度？と怪しいものがあります。

(無題) 削除/引用 No.13093-7 - 2025/08/29 (金) 10:33:36 - noname 0.1って単位は何ですかね？A260の値？

(無題) 削除/引用 No.13093-6 - 2025/08/29 (金) 09:33:18 - G25 ノートや手元の資料をざっと見てみましたが、 私が参考にした方法では、top agarを使って混釈培養してtop agarごと回収、cheese clothで濾してプラスミド精製に行くとか、Molecular Cloningだとコロニーを回収しTBなどrich. mediumで定常期まで液体培養したものを使うとか、プロトコールにマイナーなバリエーションがありますが、あまり特別なことはなくて、基本通常のプラスミド精製を踏襲すればいいです。

(無題) 削除/引用 No.13093-5 - 2025/08/29 (金) 09:29:20 - 大学院生 >[Re:3] 大腸菌さんは書きました : > 濃度がかなり薄くなってしまった＝思っていたより収率が低かった、ということですよね？ > > このくらいは取れるはず、という見積もりはどこから算出した値ですか？回収した菌体量（菌数）あたりの収率に換算したら、いつもと同じくらいということはないですか？あるいは逆に、菌体量が多すぎて十分に溶菌していなかった、もしくはカラムのキャパシティーを超えていたということはありませんか？ ご返信ありがとうございます。 濃度がかなり薄くなったというのは、完全に主観的で感想的なもので、申し訳ないです。 自分の中の指標になっているのが、クローニングの際に回収できるPlasmidの濃度で、miniprepで、薄くても0.1以上のものが取れてくる印象でした。 以前行った別のPlasmid mixtureも0.1以上はありました。 そのため、今回回収したPlasmid mixtureが、0.05-0.08あたりのものばかりでしたので、この濃度のアベレージを上げる手法はないか検討していたところでした。

(無題) 削除/引用 No.13093-4 - 2025/08/29 (金) 08:58:34 - 大学院生 >[Re:2] G25さんは書きました : > cDNAライブラリーをプラスミドベクターで作るなんていうのは30年前くらいまでよくやられたのもので、寒天培地に生やしたライブラリーのコロニーからまとめてプラスミドを取るというのも通常の手技でしたよ。 > 当時の実験書やキットの説明書を参考にしては、 ご返信ありがとうございます。 当時の文献等を参照して見てみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.13093-3 - 2025/08/29 (金) 08:05:21 - 大腸菌 濃度がかなり薄くなってしまった＝思っていたより収率が低かった、ということですよね？ このくらいは取れるはず、という見積もりはどこから算出した値ですか？回収した菌体量（菌数）あたりの収率に換算したら、いつもと同じくらいということはないですか？あるいは逆に、菌体量が多すぎて十分に溶菌していなかった、もしくはカラムのキャパシティーを超えていたということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.13093-2 - 2025/08/29 (金) 07:23:00 - G25 cDNAライブラリーをプラスミドベクターで作るなんていうのは30年前くらいまでよくやられたのもので、寒天培地に生やしたライブラリーのコロニーからまとめてプラスミドを取るというのも通常の手技でしたよ。 当時の実験書やキットの説明書を参考にしては、

寒天培地に生やしたコロニーからPlasmid mixtureの作製 削除/引用 No.13093-1 - 2025/08/28 (木) 23:46:58 - 大学院生 深夜またおかしな質問かもしれませんが失礼します。 現在ある理由により、寒天培地に大腸菌をまき、コロニーを作製させた後にそれらを全て回収(抗生剤入り液体培地をいれ、コンラージ棒で掻き取る)してPlasmid mixture(Plasmid libraryのようなもの)を作製しようと考えています。 コロニーが懸濁された液体培地を回収後、kitを用いてPlasmid mini-prepを行ったところ、濃度がかなり薄くなってしまい、Plasmidとして回収できていない可能性があります。 このやり方には、無理があるのでしょうか？ 何か経験等ございましたら、アドバイス等いただければ幸いです。

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