BioTechnicalフォーラム [プラスミドベクター溶液に誤ってPEImaxを混入させてしまった]

プラスミドベクター溶液に誤ってPEImaxを混入させてしまった

No.13108-TOPIC - 2025/09/11 (木) 17:19:56 - あたな

いつもお世話になっております。
うっかり、プラスミドベクター溶液に、1/6量のPEImaxを混入させてしまいました。
溶液はやや白濁しました。

この状態の溶液を、5/6の濃度として使用して問題ないと思われますか？
また、-30℃の凍結融解をしても問題ないと思われますか？

くだらない質問で恐縮なのですが、マキシプレップをもう一度やり直すのが大変なので、
できればこの溶液を使用したいです。

ご教授よろしくお願いいたします。
　

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No.13108-10 - 2025/10/04 (土) 03:16:12 - おお

報告ありがとうございました。

(無題)

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No.13108-9 - 2025/10/03 (金) 11:31:54 - あたな

質問から時間が経過していまっていますが、念の為ご報告させていただきます。
今回は、厳密な発現量の調節が必要ない系だったため、
HEK293Tに、PEIを混入させてしまったプラスミド溶液をそのまま使用しました。
結論から申しますと、PEIが混入していても、ウエスタンで確認する程度の過剰発現では問題はありませんでした。

別チューブに、Opti-MEM 60uL、PEImax 6uL(相当)、プラスミド 5ugを加えてボルテックスで混合し、
10min 静置後細胞に添加しました。
プラスミド溶液は凍結融解したもので、白濁していたような気がしたのでかなり念入りにタッピングしたのち使用しています。
このライセートのウエスタンを確認したところ、PEIを混入させていない溶液と比べ、細胞の状態、過剰発現具合にほとんど変化は認められませんでした。
私の場合、もともとmaxi prepで取っていたこともあり、DNA溶液の濃度が高く(1ug/uL以上)、
混入したPEIの影響は小さかったものと思われます。
ですので、今のところはエタ沈などはせず用い、今後問題が出てきたら検討しようと考えています。
今後、同じミスをしてしまった方の参考になれば幸いです。
ご回答いただいた皆様、ありがとうございました。

(無題)

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No.13108-8 - 2025/09/13 (土) 19:45:54 - ちょっとGPT

 
そうです、chatgptの答えです。

  •   ご指摘どおり、PEI複合体はゲルで分離しにくく、提案した救済策は実際にはかなり困難です。
   •   実用的には、少量で試しトランスフェクション効率と毒性を確認するか、再精製（再マキシ）するかの二択になります。
   •   収量と再現性を重視するなら、やはりやり直しが最も確実です。

(無題)

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No.13108-7 - 2025/09/13 (土) 09:23:32 - おお

>[Re:6] ちょっとGPTさんは書きました :

>
>
> どうしてもこの溶液を活かしたい場合の「救済案」

> A) アガロースゲル精製（もっとも確実にPEIを外せる）
> 1.少量を試し流ししてスーパーコイルのバンドを確認。
> 2.必要量を複数レーンに分けて流し、目的バンドのみ切り出し。

これはChatGPTの答えですか？
DNAとPEIのコンプレックスは電気泳動中でもはずれないと思います。

また、PEIの＋チャージのため電荷が中和されて移動度も遅くなっているでしょうし。そもそも凝集体を作っているものが流れるというのもちょと変。

Max prepですから収量も１mgほど、普通にプラスミドの確認をやっているスケールでは小さすぎるでしょうし。

(無題)

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No.13108-6 - 2025/09/13 (土) 06:03:59 - ちょっとGPT

結論から言うとそのまま「5/6濃度で使う」のはおすすめできません。
PEI（PEI-Max）を1/6量でも混ぜた時点で、DNAとPEIが即座にポリプレックス（複合体）を作ります。白濁＝凝集・中和域に入っているサインです。出来上がった粒子のサイズ・電荷（N/P比）が不明なため、トランスフェクション効率も細胞毒性も読めません。濃度を 5/6 に薄めても、粒子の性質は元に戻りません。
;－30℃で凍結融解も非推奨です。
凍結で粒子がさらに凝集・再配列しやすく、ばらつきが増えます。凍結融解で「元に戻る」ことは期待できません。

どうしてもこの溶液を活かしたい場合の「救済案」

PEIが結合したままだと再利用が難しいので、PEIを外してDNAを再精製できるかを試します（いずれも“ベター than nothing”の応急処置です）。

A) アガロースゲル精製（もっとも確実にPEIを外せる）
1.少量を試し流ししてスーパーコイルのバンドを確認。
2.必要量を複数レーンに分けて流し、目的バンドのみ切り出し。
3.低融点アガロース＋市販の**ゲル抽出キット（シリカ）**で回収。
&#16収量は落ちますが、PEIはほぼ除去できます。
回収後はQubit等の蛍光法で濃度確認（A260はPEIの影響でアテになりません）。

B) 塩・界面活性剤で複合体を解き→スピンカラム再精製（試してダメ元）
1.試料をNaCl 0.5–1.0 M、**SDS 0.3–0.5%**に調整し、37 °Cで10–15分静置（PEI–DNAを解離）。
2.フェノール/クロロホルム抽出→水層回収。
3.シリカ系DNAクリーンアップカラム（例：QIAquick/Monarch等）で結合→洗浄→溶出。
うまくいけばPEIをかなり減らせますが、完全に外れない場合もあります。

C) ヘパリン併用（競合置換）→カラム再精製（研究室にあれば）
ヘパリン 0.5–1 mg/mLを加えて室温10&#20分（PEIと競合）→上のBと同様にカラムでクリーンアップ。

※ アニオン交換カラム（Qiagen Plasmid系）での“かけ直し”は、PEIが残っていると結合が不安定になりやすいです。まずB/CでPEIを外してからが無難。

使うときの注意（再精製後）
;エンドトキシン低減（必要ならEndo-free条件）も再確認。
;濃度はQubit dsDNAなどで測定（A260/280はPEIで誤る）。
トランスフェクションは新しくPEI溶液を用意し、規定のN/Pで“その都度”調製してください（150 mM NaClやHEPES bufferで混合→10–20分インキュベートの通常手順）。
まずは小スケールのパイロットで細胞毒性と発現を確認。

「やり直し」が大変なお気持ちはよく分かります。まずは少量でA案（ゲル）かB案をテストスケールで試し、回収できる見込みが立ってから本量に進むのが安全です。

(無題)

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No.13108-5 - 2025/09/12 (金) 10:04:03 - おお

>[Re:4] あたなさんは書きました :

>
> ただ経験豊富なおおさんが、真っ先にエタ沈再精製を思いつく時点で、やはり新たにプラスミドを取り直すのが一番安全かと思いました。(一応問題の溶液もトランスフェクションしてみて、WBで正常に過剰発現できたか確認してみます。)
>

エタ沈はそんなに手間はかからんからやってみてもいいんやないかな。

一応PEIはDNAと凝集体を作るもので、その比率とかで凝集体の性質も違う可能性があり、好ましくない凝集体ができたあとで、正しい比率になるようにしても、望む性質の凝集体ができるかよくわからないですね。やって問題がないならラッキーというのもありかもしれませんけどね。

(無題)

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No.13108-4 - 2025/09/12 (金) 09:37:59 - あたな

使用方法としては、HEK293Tのトランスフェクションに使う予定で、
使用直前に新しいチューブに600uLのOpti-MEMと、6ugのDNA(薄まった分を考慮して問題の溶液を使用)、60uLのPEImax(問題の溶液に含まれている相当を引いた量添加)、を混合して、10秒ボルテックスして10分室温で静置して使用しようと考えていました。
問題は、PEImaxを混入してしまった溶液が白濁していたことで、もしかするとPEIがDNAと変な凝集体を形成していて、DNAが不均一になってしまっていることを懸念していました。
DNA自体が均一に取れれば、Opti-MEMで希釈しなおすことで正しくDNA-PEI複合体が形成されてくれると期待していました。

ただ経験豊富なおおさんが、真っ先にエタ沈再精製を思いつく時点で、やはり新たにプラスミドを取り直すのが一番安全かと思いました。(一応問題の溶液もトランスフェクションしてみて、WBで正常に過剰発現できたか確認してみます。)

ありがとうございました。

(無題)

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No.13108-3 - 2025/09/12 (金) 05:24:33 - おお

>[Re:1] あたなさんは書きました :

>
> この状態の溶液を、5/6の濃度として使用して問題ないと思われますか？
> また、-30℃の凍結融解をしても問題ないと思われますか？
> ご教授よろしくお願いいたします。

何に使うのよ。って前の人も質問しているけど。

とにかくそういう失敗とかした人でないとわからない世界線ですが、私ならそのままというより除くことを考えますね。ただ、ものがDNAに強く結合する性質を持っているので単純にエタ沈とかで除けるものかよくわからない。

理屈で言うとPEIのPositive chargeがDNAとの結合に大きく寄与しているだろうから、高塩濃度で剥がしてからエタ沈がいいかもしれない。NaClでも良いがNaClも濃度がたかいとエタノールに一部溶けないだろうから個人的にはLiClとか使うかなとおもう。PEIは有機溶媒例えばエタノール、メタノール、クロロフォルムといったものには溶けるようだから、PEIとDNAが分離すればエタ沈で除けるのではとおもう。なので塩を加えて白濁が解消されていることを確認してからエタノールを加えて遠心して沈降したDNAを７０％エタノールで洗ってから再溶解すればなんとかなりそうというのが理屈から考える方法。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168365906004615?via%3Dihub

ヘパリンでDNAと競合させてDNAを放出させるという方法もあるけど、ヘパリンとか糖質はアルコールで沈殿する傾向があるから、そのあとどうするのよって感じ。

(無題)

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No.13108-2 - 2025/09/11 (木) 20:44:22 - PEI

>できればこの溶液を使用したいです。

どのように使用したい？

プラスミドベクター溶液に誤ってPEImaxを混入させてしまった

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No.13108-1 - 2025/09/11 (木) 17:19:56 - あたな

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